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Biochip ou microarray - un appareil pour le diagnostic précoce des cellules cancéreuses, le suivi du traitement du cancer et le suivi de la guérison

Une biopuce est un placement organisé de molécules d'ADN ou de protéines sur un support spécial - la «plate-forme».

La plate-forme est une plaque d'une superficie de seulement 1 cm2 ou un peu plus. Il est en verre ou en plastique, ou en silicium. De nombreuses molécules d'ADN ou de protéines peuvent y être placées dans un ordre strictement défini. D'où la présence du mot «micro» dans le terme.

La biopuce peut être utilisée pour analyser des molécules de diverses substances. Pour cela, des molécules «reconnaissantes» y sont fixées. Chacune de ces molécules est désignée par le terme «molécule sonde», et chacune des molécules étudiées est

"Échantillon de molécule."

La molécule sonde sur la biopuce est déterminée par le chercheur lui-même, c'est-à-dire il planifie quelle molécule rechercher parmi les molécules du matériau étudié - dans un liquide, etc. Si l'ADN est examiné sur une micropuce, c'est une puce à ADN, si une molécule de protéine est une puce à protéine.

Comment les molécules sondes sont-elles fixées sur une biopuce?

Dans de nombreux pays, les molécules sondes se fixent directement sur une plaque de verre, c'est-à-dire au substrat à l'aide de lasers. Dans notre pays, les molécules sondes sont placées dans des cellules de gel d'un diamètre inférieur à 100 microns chacune, les cellules sont fixées sur la plaque lors de la fabrication de la micropuce. Le nombre de cellules sur la puce atteint plusieurs milliers.

Dans les cellules, les molécules sondes sont chimiquement attachées et sont dans un état fonctionnellement actif.

Étant donné que les cellules sont remplies d'un gel d'une structure tridimensionnelle, elles retiennent un plus grand nombre de molécules sondes que les puces dans lesquelles les molécules sondes sont simplement fixées à la plaque. Il est également important que la réaction chimique entre la molécule sonde et la molécule échantillon introduite dans la cellule à partir du gel se déroule comme dans les liquides, et donc comme dans un organisme vivant.

L'étude du génome et du protéome de chaque type de cellule est normale et, pour toute maladie, aidera à découvrir quel gène ou quels gènes causent telle ou telle maladie.

Sur la puce à ADN, la cause de la maladie est découverte: défauts dans la structure du gène ou des gènes, ou changements dans l'activité du gène au cours de sa structure normale.

Sur la puce à protéines, les conséquences des «pannes» du gène sont déterminées par les changements dans son produit - les protéines dans la cellule. Changements dans le gène ou la protéine cellulaire - c'est leur étiquette ou marqueur (de la marque anglaise - signe, étiquette).

Par conséquent: un gène marqué est un gène marqueur et une protéine marquée est une protéine marqueur. Ces marqueurs permettent de détecter chez un patient une cellule défectueuse ou malade caractéristique d'une maladie particulière, notamment une cellule souche cancéreuse. Dans le diagnostic de la maladie, le marqueur génétique et le marqueur protéique de contrôle sont comparés au gène normal de la cellule et à son produit - les protéines.

Il est clair que sur la puce à ADN, la molécule sonde est le gène marqueur, et pour le contrôle dans une cellule séparée, le gène normal, dans la puce à protéine, l'anticorps ou l'antigène peuvent être utilisés comme molécule sonde.

Méthodes de fabrication de biopuces

1. Les molécules d'ADN ou de protéines sont pré-synthétisées puis placées sur une matrice. L'inconvénient de cette méthode est la faible densité de la molécule sonde sur la matrice - jusqu'à 1000 molécules et le processus long de leur synthèse.

Des copies du gène marqueur peuvent être obtenues par la méthode PCR-MMK, il n'existe pas une telle méthode pour les copies de la protéine marqueur. Ses copies peuvent être créées en incorporant l'ARNm du gène de la protéine marqueur dans la bactérie: E. coli ou dans les cellules de levure.

2. Pour les puces à ADN, la synthèse des oligonucléotides s'effectue directement sur la matrice. Ces puces ont une densité beaucoup plus élevée de molécules sondes.

3. Application d'oligonucléotides à un endroit strictement défini dans la matrice par une imprimante à jet d'encre.

Dans notre pays, les biopuces - une puce à ADN et une puce à protéines sont préparées selon la première méthode.

La biopuce est le dernier appareil de la médecine du 21e siècle. Par molécules marqueurs, il vous permet de:

1) diagnostiquer toute maladie: avant son début ou au tout début;

2) trouver dans le corps un virus, des bactéries et des cellules cancéreuses particuliers;

3) avec une puce protéique, des médicaments peuvent être trouvés parmi les composés de faible poids moléculaire dans un certain nombre de matériaux analysés;

4) la solution de ces problèmes sur les biopuces peut se faire en quelques heures, pas en jours, etc.

Le principe des biopuces et des étapes d'analyse

1. Puce à ADN.

Nous savons qu'une molécule d'ADN est constituée de deux chaînes complémentaires. La base de chaque chaîne est une séquence de quatre bases azotées: adénine (A), guanine (G), thymine (G) et cytosine (C).

Dans ce cas, la séquence de bases d'une chaîne détermine la séquence de bases dans une autre: AT et GC. Lorsque des liaisons hydrogène se forment spontanément entre ces bases complémentaires, les deux chaînes sont connectées, c'est-à-dire s'hybrider en une double hélice et maintenir les chaînes ensemble. C'est sur la capacité des bases complémentaires à se lier les unes aux autres: A avec T, et G avec C, le principe de la puce à ADN est basé.

Étapes d'analyse des puces à ADN

1. Dans les cellules de la puce, des copies fixes du gène marqueur connu sous la forme d'une seule chaîne de ce gène, à savoir ses «moitiés» sont l'ADNc.

2. Une copie du gène marqueur, c'est-à-dire ARNm.

3. En utilisant l'enzyme transcriptase inverse, une autre chaîne du gène marqueur est synthétisée sur la molécule d'ARNm. sa seconde moitié est l'ADNc. La PCR-MMK propage cet ADNc - ce sont des molécules échantillons, et elles sont marquées avec un colorant fluorescent.

4. Le robot place les molécules d'échantillon dans des cellules spécifiques sur la puce avec une copie des gènes marqueurs de la cellule souche cancéreuse.

Si l'ADNc de gènes d'un échantillon de plasma est complémentaire de l'ADNc dans les cellules correspondantes, alors l'hybridation se produira entre eux et ces cellules commenceront à briller. La puce est balayée par un laser, surveillant l'intensité du signal de fluorescence dans chaque cellule. C'est-à-dire qu'il y a des gènes marqueurs dans le plasma, ce qui signifie qu'il y a des cellules souches cancéreuses dans le corps du patient.

S'il n'y a pas d'hybridation entre ces molécules, alors il n'y a pas de gène marqueur pour la cellule souche cancéreuse dans cet échantillon de plasma.

Lorsqu'il y a un gène avec une mutation, il y aura alors une hybridation de son ADNc sur la puce avec l'ADNc de la molécule sonde ayant cette mutation. S'il s'agit du gène suppresseur wt53, cela peut également indiquer la présence d'une ou de plusieurs cellules souches cancéreuses dans le corps du patient.

Une cellule cancéreuse provient d'une cellule souche d'un tissu en raison de l'inclusion de gènes de protéines fœtales. Par conséquent, l'ADNc de ces gènes et leur absence dans le contrôle se trouvent dans les molécules plasmatiques du patient.

Moins il y a de titre de gènes marqueurs épimutants et mutants dans l'échantillon de plasma d'un patient, moins il y a de cellules cancéreuses dans son corps.

La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de plasma sanguin ou d'autres fluides biologiques d'un patient - urine, salive, liquide lacrymal, etc., par des gènes marqueurs permet de diagnostiquer le cancer, et les propriétés d'invasion de marqueurs cancéreux indiquent des micrométastases cancéreuses par des gènes marqueurs. Et c'est bien avant qu'ils ne soient détectés par des méthodes standard - échographie, radiographie, tomodensitométrie, etc.

La biopuce des gènes marqueurs peut identifier la menace de la maladie. Donc, si des gènes marqueurs sont trouvés, mais que leurs produits, les protéines dans la cellule, ne sont pas encore présents, il s'agit d'une détection préalable à la maladie. En ce qui concerne le cancer, ce sont des cellules précancéreuses. Étant donné que dans ce cas, la biopuce ne révèle que la probabilité de maladie, une telle puce n'a pas encore été certifiée.

Le plasma sanguin du patient est le principal réservoir où les gènes marqueurs des cellules défectueuses ou malades mourantes pénètrent au cours d'une maladie spécifique à partir de divers organes, y compris les cellules cancéreuses. De telles cellules dans le corps peuvent mourir à cause de la nécrose et de l'apoptose, et leurs gènes pénètrent ensuite dans le sang à travers le liquide intercellulaire.

Un faible titre de gènes marqueurs dans le plasma sanguin du patient par analyse sur une puce à ADN et l'absence de leur produit, des protéines, peuvent signifier une pré-maladie, et s'ils sont présents, il peut s'agir d'une maladie. Dans le même sens, cela s'applique également au cancer. Cela pourrait signifier un diagnostic précoce du cancer - son niveau II.

2. Puce protéinée.

La structure de la puce pour l'analyse des protéines est la même que celle des puces à ADN. Seules les puces sur lesquelles la réaction enzymatique a lieu ont une disposition cellulaire plus rare, et celles sur lesquelles la réaction ADN a lieu sont plus fréquentes.

Les protéines marqueurs sont le produit de «pannes» d'un gène ou de gènes, elles transforment une cellule normale en cellule défectueuse ou malade dans une maladie particulière. Ces protéines apparaissent à la surface des cellules et sont des protéines antigéniques et pour chaque maladie, elles sont différentes.

Les protéines fœtales et les protéines réceptrices apparaissent sur les cellules souches cancéreuses, mais pas sur les cellules souches normales. Qu'il s'agisse de protéines antigéniques est un problème non résolu.

Dans une puce de protéine comme molécule sonde, c'est-à-dire
une protéine marqueur d'une cellule défectueuse ou malade peut être un antigène protéique, puis les anticorps dirigés contre elle sont déterminés dans le sérum du patient. Si un anticorps est prélevé par une molécule sonde, un antigène protéique est alors recherché dans le sérum sanguin du patient.

Dans le cadre du décodage du génome humain, une analyse des fonctions d'un grand nombre de protéines dans différents types de cellules, y compris des cellules jusqu'alors inconnues, est nécessaire. Des milliers de protéines peuvent être fixées dans différentes cellules de la micropuce et analysées simultanément pour leur capacité à: lier un ligand connu, catalyser une réaction enzymatique particulière, interagir avec des anticorps, des composés de faible poids moléculaire, etc.

Dans une cellule cancéreuse, il est important d'étudier, en plus des protéines marqueurs, des protéines réceptrices et des anticorps dirigés contre celles-ci, les protéines de propriétés d'invasion, le facteur de croissance endothélial vasculaire-1 et sa protéine réceptrice à la surface d'une cellule hématopoïétique, etc.

Le principe de la puce protéique

Elle est également basée sur la complémentarité des molécules participantes, mais protéiques.

1. Antigène avec son anticorps. Un antigène est une substance qui contient généralement une sorte de protéine pouvant déclencher une réponse immunitaire.

Un anticorps est une molécule de protéine sécrétée par l'une des cellules du système immunitaire. La forme de cette molécule et la répartition de la charge électrique à sa surface la rendent capable de se lier à un antigène complémentaire de forme et de répartition de la charge.

Pour la première fois en 1942, le lauréat du prix Nobel L. Pauling et ses collègues ont avancé le postulat correct selon lequel la structure tridimensionnelle de l'antigène et de ses anticorps

sont complémentaires et donc «responsables» de la formation du complexe - antigène - anticorps.

2. Le substrat avec son enzyme. Sur la base de l'hypothèse de correspondance topochimique, la spécificité de l'action enzymatique est associée à la reconnaissance de la partie du substrat qui ne change pas lors de la catalyse. Des contacts ponctuels et des liaisons hydrogène apparaissent entre cette partie du substrat et le centre du substrat de l'enzyme.

3. Protéine avec un composé de bas poids moléculaire. Pour l'inhibition des protéines, une connexion entre eux est nécessaire - une surface complémentaire du composé avec les parties actives de la molécule de protéine,

4. Une enzyme avec un composé de faible poids moléculaire. Les enzymes et autres protéines créent toutes les propriétés d'une cellule cancéreuse, elles sont donc les principales cibles des médicaments. Pour le blocage de l'enzyme par un composé de bas poids moléculaire, une complémentarité entre eux est également nécessaire: la surface de la molécule du composé doit être une copie de la surface du substrat, qui ne change pas lors de la catalyse.

Étapes d'analyse des puces de protéines

1. Dans les cellules de la puce est fixée une protéine-anticorps connue à une protéine qui crée une cellule défectueuse ou malade d'une maladie particulière. La protéine souhaitée est une protéine marqueur.

2. Un échantillon de sérum est prélevé du sérum sanguin d'un patient pour analyse. Un colorant fluorescent est ajouté à l'échantillon - chaque molécule de la protéine marqueur reçoit cette substance.

3. À l'aide d'un robot, les gouttelettes de sérum de l'échantillon sont placées dans des cellules spécifiques de la puce. Les molécules sondes recherchent des molécules complémentaires parmi les molécules échantillons. S'il existe une telle molécule, elle se lie à la molécule sonde dans la cellule à puce; une réaction chimique se produit entre eux, et elle commence à briller.

4. Les cellules dans lesquelles une lueur brillante est apparue indiquent la présence de la protéine marqueur de protéine souhaitée. Étant donné que cette protéine marqueur provient d'une cellule défectueuse ou malade dans une maladie particulière, cela indiquera l'apparition du patient de cette maladie. De la même manière, la présence dans le corps du patient d'une ou de plusieurs cellules cancéreuses est détectée par leurs protéines marqueurs.

Si un antigène protéique est fixé dans les cellules de la puce, alors des anticorps contre la protéine marqueur sont recherchés dans le sérum sanguin du patient. Si des anticorps dirigés contre la protéine marqueur apparaissent dans le sérum, cela indiquera la présence de cellules cancéreuses dans le corps du patient, c'est-à-dire le patient est malade. Et selon les protéines marqueurs, les propriétés de l'invasion des cellules cancéreuses, par exemple, par la présence de la protéine Mts1 et d'autres, peuvent être enregistrées quelque part dans le corps du patient avec des micrométastases des cellules cancéreuses.

Nous savons déjà que les protéines qui se forment dans les cellules cancéreuses mais qui sont absentes dans les cellules normales sont des protéines marqueurs ou des antigènes. La présence de telles protéines est un signe que le gène qui cause la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse a commencé son travail destructeur. La détection des cellules cancéreuses par des protéines marqueurs permet de diagnostiquer le cancer ou ses micrométastases bien avant que les symptômes du patient ne soient détectés. Le titre de la protéine marqueur dans le sérum sanguin du patient détermine le nombre de cellules cancéreuses dans son corps. Un faible titre de protéines marqueurs des cellules cancéreuses dans le sérum sanguin, ainsi que dans d'autres fluides du patient, est le signe d'un petit nombre de cellules cancéreuses dans le corps du patient. Cela pourrait être un diagnostic précoce du cancer - son niveau II.

Ainsi, au 21e siècle, lorsque les gènes marqueurs et les protéines marqueurs qui causent une maladie spécifique sont identifiés, son diagnostic, y compris le cancer, deviendra précoce, c'est-à-dire à deux niveaux: 1) «avant le début» - selon les gènes marqueurs et 2) «au tout début» - selon les protéines marqueurs.

Les gènes marqueurs et les protéines marqueurs dans une cellule défectueuse ou malade sont des objectifs ou des cibles pour de nouveaux médicaments. Sur cette base, des médicaments et d'autres médicaments seront créés, y compris des vaccins. En raison de la complémentarité avec les molécules cibles, les médicaments agissent de manière sélective sans endommager les cellules normales.

Le médecin, agissant sur les gènes marqueurs de la maladie, pourra la prévenir, et en agissant sur les marqueurs protéiques des cellules, il pourra être guéri dans "l'embryon" lui-même.

De ces deux manières, le médecin recevra, pour ainsi dire, un pouvoir complet sur toute maladie au niveau cellulaire.

La recherche de gènes marqueurs et de protéines marqueurs dans divers environnements du corps du patient peut être effectuée rapidement et avec précision sur des biopuces, et les gènes marqueurs, en plus, peuvent être détectés en utilisant les méthodes les plus précises: PCR-MMK et MS-PCR. Cela signifiera une révolution dans la médecine.

Les scientifiques identifieront les gènes marqueurs et les protéines marqueurs qui provoquent une maladie spécifique, y compris l'apparition de cellules cancéreuses. Il sera alors possible de développer un minimum d'ensembles pour le diagnostic précoce de toute maladie: gènes marqueurs et protéines marqueurs. Ils seront complétés et affinés à mesure que de nouvelles connaissances seront acquises. Ce seront les «profils» de gènes et de protéines de la maladie, qui seront transférés sur des biopuces.

Tester une personne pour les marqueurs d'une maladie spécifique à l'aide d'une puce à ADN et d'une puce à protéines présente plusieurs avantages.

Un résultat négatif - apportera de la joie à une personne et pourra la sauver de l'examen par des méthodes standard: échographie, radiographie, etc.

Un résultat positif - donnera à une personne l'occasion, ainsi que le temps de prendre des mesures pour réduire le risque d'une maladie, ou à son début - de commencer un traitement approprié.

Le diagnostic précoce du cancer est particulièrement important. Cela est dû au fait que, premièrement, le cancer est causé par une cellule cancéreuse, et il provient de la cellule de son organisme hôte et, deuxièmement, jusqu'à récemment, les différences absolues entre une cellule cancéreuse et une cellule normale n'étaient pas connues.

On pense toujours que chaque type de cellule cancéreuse est caractérisé par ses «propres» gènes et protéines. Mais le génome dans la cellule de chaque type est le même. Si nous supposons que pour chaque type de cellule, la cellule cancéreuse est «la sienne», alors pourquoi les propriétés des cellules cancéreuses de tout type sont-elles les mêmes?

Un type cellulaire est créé par la répression de certains gènes - en raison de la méthylation et de l'expression d'autres gènes - en raison de la déméthylation de leur promoteur.

Maintenant, il a également été prouvé qu'une cellule de tout type devient cancéreuse en raison de la répression des gènes des protéines fœtales qu'elle contient. Autrement dit, la formation d'un type cellulaire et l'émergence d'une cellule cancéreuse à partir d'une cellule normale sont des processus indépendants les uns des autres. À partir de ces deux faits, nous pouvons supposer qu'il devrait y avoir des gènes marqueurs communs et leur produit - des protéines pour tout type de cellule souche cancéreuse.

Gènes communs et leurs produits - les protéines peuvent être: un gène et son enzyme - télomérase, un gène et une protéine sous la désignation de code "5T4", un gène oct-4 et une protéine oct-4, un gène Nanog et une protéine, un gène mts 1 et une protéine Mts 1, gène et protéine d'ostéopontine, etc.

Si cela se confirme, ce sera une véritable percée dans la résolution de nombreux, sinon tous, les problèmes de cancer:

- diagnostic précoce et précis de tout type de cellule souche cancéreuse sur la base d'un gène marqueur commun et de son produit, une protéine marqueur;

- des médicaments et des moyens universels, y compris un vaccin, contre une cellule souche cancéreuse et ses métastases.
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Biochip ou microarray - un appareil pour le diagnostic précoce des cellules cancéreuses, le suivi du traitement du cancer et le suivi de la guérison

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