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Puce à ADN pour le diagnostic des cellules cancéreuses d'une tumeur primitive et des métastases plasmatiques d'un patient

Étant donné que la dissémination des cellules cancéreuses commence par un nodule de ces cellules de 1 à 2 mm de diamètre, le cancer ne peut être guéri que par son diagnostic précoce.

Au XXIe siècle. les principaux gènes marqueurs et protéines marqueurs qui transforment une cellule normale en cellule cancéreuse seront connus. Ils seront utilisés pour le diagnostic précoce des cellules cancéreuses.

Le diagnostic précoce du cancer est le diagnostic de son apparition. Le diagnostic du cancer avant son apparition est encore plus important.

«Avant le début» est une cellule dans laquelle il existe déjà des épimutations des gènes des propriétés de la cellule et des mutations ou épimutations des gènes suppresseurs et des gènes de réparation de l'ADN. Il s'agit d'une cellule précancéreuse. Ses méthodes morphologiques de recherche ne diffèrent pas de la normale.

Le «début» est la première cellule cancéreuse à partir de laquelle sa progéniture se forme ensuite, c'est-à-dire cancer

Les changements dans les gènes et les épimutations sont des étiquettes ou des marqueurs des cellules cancéreuses. Ils distinguent les cellules cancéreuses de la normale.

Dans les tissus de l'organisme, une partie des cellules cancéreuses meurent d'apoptose ou de nécrose, et leurs gènes mutants et épimutants pénètrent dans la circulation sanguine par la lymphe. En raison de la nature mosaïque des capillaires de la tumeur, à commencer par un nodule de cellules cancéreuses de 1 à 2 mm de diamètre, une partie des cellules cancéreuses de la paroi vasculaire pénètre facilement dans le sang. Certaines cellules restent vivantes dans le sang, tandis que d'autres meurent, mais laissent leur marque - des fragments de gènes avec des mutations et des épimutations.

Comme il n'y a pas d'ADN à l'extérieur des cellules dans des conditions normales, la détection dans le plasma sanguin ou d'autres fluides du patient - urine, salive, liquide lacrymal et autres gènes marqueurs - équivaut à détecter leur porteur, c'est-à-dire cellules cancéreuses.

Le sang du patient est le principal réservoir dans lequel l'ADN des cellules cancéreuses de différents tissus du corps pénètre.

Au XXIe siècle. La puce à ADN pour les gènes marqueurs détectera les cellules défectueuses d'une maladie particulière, y compris le cancer. En peu de temps - des heures, pas des jours, cet appareil vous permettra de trouver tous les changements dans les gènes d'une ou de plusieurs cellules cancéreuses bien avant les symptômes du cancer.

Dans la section précédente, nous avons discuté des biopuces, ici nous mettons en évidence les objectifs de la puce à ADN.

Un gène est un fragment d'une molécule d'ADN de deux chaînes de nucléotides; la partie principale du nucléotide est l'une des quatre bases: A, T, G, C.

Les chaînes nucléotidiques du gène sont maintenues ensemble grâce à la complémentarité des paires de bases: A avec T, G avec C. Elles sont reliées par un processus spontané de formation de liaisons hydrogène entre elles. Ce phénomène - la formation de paires de bases, est appelé hybridation. Le principe de l'action de la puce à ADN est basé sur ce phénomène.

Pour cela, les molécules échantillons sont isolées d'une cellule cancéreuse ou d'un échantillon de plasma sanguin d'un patient. Ils sont étiquetés avec un colorant fluorescent et introduits dans la cellule de la puce à l'aide d'un robot.

Les molécules sondes sur la puce sont capables d'attraper uniquement une molécule complémentaire à elles-mêmes des molécules échantillons, c'est-à-dire la deuxième chaîne nucléotidique d'un gène particulier.

Si une telle molécule apparaît parmi les molécules de l'échantillon, elle s'hybridera avec la molécule sonde. Cela peut être observé: la cellule commence à briller - plus il y a de molécules fortes et hybrides. C'est l'essence du principe de "travail" de cette puce.

Mais pour détecter la présence dans le corps d'une ou de plusieurs cellules cancéreuses dans les molécules de la sonde sur la puce, toutes les épimutations et mutations possibles d'un gène particulier doivent être contenues en plus d'une copie normale de ce gène sur la puce.

Pour la première fois en pratique, le phénomène d'hybridation de paires de bases a été utilisé par Ed. Southern en 1975. Il a utilisé une molécule sonde marquée pour déterminer le brin complémentaire des nucléotides du gène parmi les molécules sondes fixées sur la puce. C'était un prototype de puce à ADN. À la fin des années 80. notre scientifique est acad. A.D. Mirzabekov a mis en œuvre l'idée d'hybridation de molécules dans notre pays en créant une puce à ADN.

Quelles sont les principales utilisations d'une puce à ADN?

1. Déterminer quels gènes d'une cellule normale de chaque type sont actifs et lesquels sont «silencieux».

2. Comparer l'activité des gènes dans une cellule normale d'un type donné avec l'activité des gènes dans une cellule cancéreuse de ce type. Cela permettra d'identifier les gènes responsables des cellules cancéreuses.

3. Découvrez si les changements dans les gènes d'une cellule cancéreuse - leurs défauts ou leurs changements d'expression - dépendent du type de cellule.

4. Pour déterminer les changements dans quels gènes et dans ce qui se trouvent dans la cellule cancéreuse plus souvent que d'autres.

5. Suivi du traitement du cancer et de sa guérison par la disparition dans le plasma sanguin du patient des gènes marqueurs des cellules cancéreuses.

Types de mutations

1. La substitution est le remplacement d'une paire de bases dans une molécule de gène par une autre. Exemple: AT à GC.

2. Un insert est une paire supplémentaire de bases ou même plusieurs d'entre elles dans un gène. Exemple: une nouvelle paire de bases d'AT dans le gène.

3. Suppression - la perte d'une ou plusieurs paires de bases dans un gène. Exemple: G-C est absent quelque part dans la séquence de base.

Une mutation dans un gène est exprimée dans son produit, c'est-à-dire dans ses protéines - la séquence des acides aminés dans une protéine est modifiée. Si ce gène régule normalement la division cellulaire, alors dans le cas d'une mutation de ce gène, une telle cellule peut devenir cancéreuse.

Une cellule cancéreuse peut provenir d'une cellule normale non seulement à cause d'épimutations et de mutations dans un certain nombre de gènes, mais aussi à la suite d'une activité génique excessive. Cela conduit à un excès dans la cellule du nombre de copies de ce gène, c'est-à-dire L'ARNm, ce qui signifie une structure normale, mais un excès de cette protéine.

Exemple: le gène c-myc dans de nombreux types de cellules active l'ARN polymérase de type III 12 à 15 fois par rapport à une cellule normale, ce qui conduit à la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse.

Dans chaque cas de cancer chez un patient, il est nécessaire de déterminer les «causes moléculaires» des propriétés de ses cellules cancéreuses: changements dans l'expression des gènes en eux, y compris les gènes d'invasion, de mutation et d'épimutation dans les gènes suppresseurs et la réparation de l'ADN.

Comment trouver une mutation génétique à l'aide d'une puce à ADN?

Pour identifier tout type de mutation dans le gène, tous les types de mutations de ce gène doivent être introduits dans les molécules sondes lors de la synthèse des molécules.
Après cela, ils sont placés dans les cellules de la puce à ADN.

Un mélange d'un échantillon d'ADN est préparé à partir des cellules ou ici un échantillon du plasma sanguin du patient. Chacun d'eux est marqué avec un colorant fluorescent et introduit dans les cellules d'un gène connu par un robot.

Si une hybridation de la molécule sonde avec la molécule échantillon se produit dans la cellule, le puits commencera à briller. Il en résultera une conclusion: dans le gène de l'échantillon de plasma, il y a une épimutation ou une mutation. Cela signifie que le patient a une ou plusieurs cellules cancéreuses.

En sachant quel gène se trouve dans cette cellule et quelle mutation ou épimutation s'y trouve, ainsi qu'en le comparant à une copie normale du gène dans la cellule de contrôle sur la puce, nous découvrons quel est le gène modifié dans le plasma sanguin du patient.

La mesure du degré de luminescence dans le puits de gel nous indiquera le titre d'un gène mutant ou épimuté dans un échantillon de plasma sanguin: plus le titre est bas, moins il y a de cellules cancéreuses dans le corps du patient.

Comment déterminer l'expression des gènes à l'aide d'une puce à ADN?

Le génome humain a été déchiffré et la tâche principale des scientifiques est de découvrir le plus rapidement possible les fonctions de chaque gène dans la cellule de chaque type et pour le corps dans son ensemble.

Pour déterminer l'activité d'un gène dans une cellule, des molécules d'ADN simple brin, c'est-à-dire "Des moitiés" de gènes. Jusqu'à 10 000 gènes peuvent être placés sur une puce de 1 cm2.

Comment fonctionne la puce, nous le savons déjà. Lors de l'hybridation avec la deuxième chaîne d'un gène donné, c'est-à-dire avec sa seconde «moitié», l'ADN double brin se forme.

Il diffère des régions à chaîne unique en ce qu'il est capable de «s'accrocher» aux moitiés d'une molécule de gène avec un colorant fluorescent qui brille dans sa région spécifique du spectre. Ainsi, la mise en évidence des gènes actifs dans la cellule se produit.

D'où vient la deuxième chaîne génétique? Il peut être obtenu à partir de la cellule étudiée qui, à différents moments de sa vie et de ses fonctions, comprend divers «ensembles» de gènes dans son génome. Pour notre objectif, il est obtenu à partir du plasma sanguin d'un patient, où tombent des fragments de gènes de cellules cancéreuses mortes.

Il est connu que les gènes actifs synthétisent des molécules d'ARN d'information sur leur matrice, c'est-à-dire ARNm. Ensuite, ces molécules sont utilisées pour la synthèse des protéines.

En utilisant l'enzyme transcriptase inverse de virus du cancer, une copie d'ADN simple brin est obtenue avec l'ARNm, c'est-à-dire la seconde moitié du gène est l'ADNc.

Les molécules échantillons sont transférées dans les cellules de la puce par un robot, c'est-à-dire ADNc Si la molécule sonde est complémentaire de l'ADNc, alors l'hybridation se produit entre eux avec la formation d'un gène double brin. Une telle cellule ou des cellules sur la puce s'allumeront. Plus le degré de luminescence dans la cellule de gel est élevé, plus le titre de ce gène dans le plasma du patient est élevé, ce qui signifie plus de cellules cancéreuses.

Détection d'une ou de plusieurs cellules cancéreuses dans un échantillon de plasma sanguin d'un patient par des marqueurs: épimutations et mutations de gènes ou amplification de gènes permet de détecter le cancer chez un patient à ses tout débuts et même avant son début, c'est-à-dire bien avant le début de ses symptômes. Un faible titre de gènes marqueurs dans le plasma sanguin du patient analysé sur une puce à ADN devrait signifier le nombre minimum de cellules précancéreuses et / ou cancéreuses dans son corps.

Les puces à ADN permettent d'obtenir des «profils» d'expression génique dans chaque type de cellules normales ou défectueuses. Avec leur aide, il a déjà été possible de découvrir que pour les cellules normales et cancéreuses, ces profils sont différents.

La transformation d'une cellule normale de tout type en un cancer après l'action de tout cancérigène sur elle. Mais quand et sur quelle cellule et où dans le corps humain les produits cancérigènes ou d'oxydation de l'oxygène ont agi, ce qui, peut-être, le plus souvent, nous est toujours inconnu.

Mais en même temps, les cellules cancéreuses ont les mêmes propriétés sinistres, quel que soit le type de cellule et la classe de cancérogène qui ont causé sa formation. Cela nous fait penser qu'une cellule cancéreuse de tout type peut provenir des mêmes changements dans les gènes.

Si cela est confirmé, il est plus facile de créer un ensemble minimal de gènes marqueurs qui provoquent la transformation d'une cellule normale de tout type en cellule cancéreuse. Les gènes marqueurs seront placés sous forme de molécules sondes dans les cellules de la puce à ADN et fixés dans celles-ci. À l'avenir, chaque personne pourra porter une telle puce de la même taille minuscule sur sa main. La puce sera complétée par une puce pour analyser ses informations.

Des analyses constantes, mais non rares tout au long de l'année, du plasma de son sang et d'autres fluides biologiques pour les épimutations et autres modifications des gènes de ce kit permettraient d'identifier le «vestibule» même du cancer, c'est-à-dire, son "début", et encore plus fiable - "avant le début" de celui-ci.

Si un tel «seuil» de cancer est détecté, à notre avis, un traitement prophylactique d'un tel patient devrait être commencé pour détruire ces premières cellules précancéreuses et / ou cancéreuses dans le corps du patient. Un certain nombre de méthodes à cet effet ont déjà été développées, mais elles commencent tout juste à «entrer» dans la pratique clinique.

Le choix des médicaments et des agents doit être déterminé par les causes moléculaires de la formation des cellules cancéreuses chez un patient particulier. Ces raisons seront des cibles pour les médicaments et les remèdes. Parmi eux, il pourrait y avoir: des anticorps monoclonaux, des copies normales des gènes suppresseurs et des gènes d'apoptose à l'aide d'un virus modifié, à l'avenir - le mTCR avec une substance médicamenteuse, de petits ARN interférents pour détruire les ARNm des gènes responsables, et d'autres. Ceci est important, car la place de la formation de telles cellules dans le corps du patient aux stades "début" et encore plus "avant le début" ne peut être trouvée par aucune méthode autre que des méthodes basées sur des gènes marqueurs et des protéines marqueurs de cellules cancéreuses.
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Puce à ADN pour le diagnostic des cellules cancéreuses d'une tumeur primitive et des métastases plasmatiques d'un patient

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