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CARACTÉRISTIQUES STRUCTURELLES ET FONCTIONNELLES DES GÈNES DANS LE DIAGNOSTIC ET LE TRAITEMENT DU CANCER

Karpukhin A.V.1, Bavykin A.S.1, N.V. Apanovich1, Korotaeva A.A.1, Shubin V.P.1,

Syrtsev A.V.1, Pospekhova N.I.1, Loginova A.N.1, Peters M.V.2, Kashurnikov A.Yu.2, Zenit-Zhuravleva E.G.1, Goncharova E.A.1 , Gritsay A.N.,? Lyubchenko L.N.2,

Matveev V.B.2, Tyulyandin S.A2.

1Centre de recherche en génétique médicale du RAMS;

2 Centre russe de recherche sur le cancer. Blokhina RAMS, Moscou

Les principaux problèmes du traitement thérapeutique du cancer sont le manque d'efficacité des médicaments et leurs effets secondaires importants dus à la faible sélectivité de la chimiothérapie existante. La faible efficacité de la thérapie, en plus de l'absence ou de la faible représentation de médicaments très efficaces, est également due à l'hétérogénéité des tumeurs cancéreuses même d'une localisation en fonction des troubles génotypiques. En conséquence, les cancers du même type et de la même origine répondent différemment à la pharmacothérapie. Les avancées récentes dans l'étude du génome des cellules cancéreuses ouvrent la possibilité de créer des thérapies contre le cancer sur une base fondamentalement nouvelle. En bloquant l'action de certains gènes, il est possible d'interrompre le développement d'une tumeur ou de provoquer la mort des cellules cancéreuses. La façon la plus moderne de «désactiver» les gènes est basée sur le phénomène récemment découvert d'interférence avec l'ARN.

L'interférence ARN est un phénomène naturel inhérent à l'inclusion de l'homme. L'avantage de son application pour l '«arrêt» requis des gènes est sa haute sélectivité et son activité fonctionnelle naturelle compréhensible.

Cependant, leur application pratique est limitée à un certain nombre de problèmes non résolus. L'un d'eux consiste à identifier les gènes dont l'inhibition sera la plus efficace pour tuer les cellules cancéreuses avec un minimum d'effets secondaires. Les ARNm artificiels eux-mêmes constituent un outil puissant pour identifier de tels gènes. La forte hétérogénéité des tumeurs cancéreuses d'une seule localisation rend la caractérisation moléculaire des cellules cancéreuses cruciale, ce qui permettra de déterminer les tumeurs «sensibles» et d'individualiser davantage le traitement. Ce facteur n'est pas encore suffisamment pris en compte dans le développement de médicaments ciblés.

La relation de l'hétérogénéité fonctionnelle et structurelle du cancer avec le traitement thérapeutique. Nous étudions les caractéristiques fonctionnelles de plus de 20 gènes impliqués dans la nucléation et le développement du cancer dans un certain nombre de localisations. Pour ces gènes, les méthodes de détermination quantitative du niveau d'expression déterminé dans les tissus sains et tumoraux du rein ont été optimisées. La quantification de l'expression des gènes est réalisée en utilisant la PCR-PB en utilisant un instrument Step One Plus (Applied Biosystems; USA). En particulier, un panel de gènes liés au développement du cancer du rein a été formé. Les critères de sélection des gènes étaient l'importance des gènes pour le développement du cancer du rein, leur présence dans la chaîne pathogène des troubles fonctionnels et la présence de médicaments ciblés déjà existants pour ces gènes. Les panels de gènes générés ont été analysés, dont les profils d'expression indiquent les processus fonctionnels dans la tumeur d'un patient particulier. Les résultats de l'analyse des profils d'expression peuvent être utilisés comme marqueurs pronostiques de la réponse à la thérapie, indiquant des cibles potentielles d'effets thérapeutiques. Nous avons obtenu des profils d'expression génique comparatifs (dans des tissus cancéreux et sains) pour un certain nombre de patients. Le plus souvent, une augmentation du niveau d'expression dans le cancer du rein à partir de 12 gènes étudiés est observée dans les gènes VEGFR1, VEGFR2 et VEGF, indiquant le besoin fréquent de bloquer les gènes associés aux processus d'angiogenèse. Une expression accrue d'au moins deux de ces gènes a été observée dans tous les cas étudiés; dans la moitié des cas, les trois de ces gènes ont été activés. Trouvé une diminution fréquente de l'expression du gène PDGFR? avec un cancer du rein. Dans la fig. un exemple des niveaux d'expression d'un certain nombre de gènes du panel étudié dans une tumeur d'un patient atteint d'un cancer du rein est donné en relation avec le niveau d'expression dans le tissu rénal normal du même patient.

Fig.

Niveaux d'expression d'un certain nombre de gènes dans une tumeur cancéreuse du rein par rapport à l'expression dans le tissu rénal normal

.

L'abscisse donne les gènes: 1 - VEGFR1, 2 - VEGFR2, 3 - VEGF121, 4 - PDGFR?, 5 - PDGFR?,

6 - PI3K, 7 - PTEN, 8 - AXL, 9 - mTOR, 10 - EGFR.

L'axe des ordonnées est le rapport des niveaux d'expression de ces gènes dans la tumeur et dans les tissus normaux. Les valeurs négatives sont données pour plus de clarté et reflètent des valeurs d'expression plus faibles dans la tumeur par rapport aux tissus normaux.

Le niveau d'expression le plus prononcé (d'un ou deux ordres de grandeur) différait dans la tumeur par rapport aux tissus sains dans les gènes VEGFR1 et PDGFR. Et le niveau d'expression le plus bas du gène PDGFR? (500 fois plus faible que la normale) correspondait à la plus petite variation de l'expression du gène VEGFR1 dans une tumeur par rapport aux tissus sains. A l'inverse, un niveau d'expression inchangé du gène PDGFR? correspondait à une augmentation d'environ 80 fois du niveau d'expression du gène VEGFR1 dans la tumeur. Aucun changement d'expression dans les gènes PDGFR n'a été trouvé dans les échantillons de tumeurs étudiés et PI3K. Dans la moitié des cas de tumeurs, l'expression du gène EGFR a été augmentée. L'expression du gène PTEN a augmenté de 4 fois dans la tumeur et a diminué de 2,5 fois par rapport au tissu témoin. Dans deux cas, l'expression du gène AXL a été augmentée, ce qui indique un pronostic défavorable de l'évolution de la maladie.

Un certain nombre d'auteurs de ce rapport déterminent l'expression du gène HER2, qui est important pour décider de l'utilisation de l'herceptine (trastuzumab) dans le traitement du cancer du sein, et du gène PTEN, dont le niveau d'expression est associé à l'efficacité de l'herceptine. Si le cancer du sein est résistant à l'herceptine avec perte d'expression du gène PTEN, alors, avec une tumeur cancéreuse du cerveau - glioblastome multiforme, l'utilisation de la rapamycine, au contraire, est efficace. Une faible expression du gène BRCA1 indique une survie accrue à la chimiothérapie pour le cancer du poumon non à petites cellules en utilisant l'hémicitabine / cisplatine. Pour une thérapie efficace, en plus des caractéristiques fonctionnelles des cellules cancéreuses, il est important de prendre en compte les changements structurels de leur génome. À cet égard, nous déterminons des mutations dans les gènes KRAS, PTEN et BRAF qui sont pertinentes pour prédire l'efficacité d'un traitement ciblé pour le cancer d'un certain nombre de localisations (cancer du côlon, cancer du poumon, leucémie à cellules T, mélanome, etc.), détermination moléculaire de la recombinaison BCR- ABL.

L'étude des mutations du gène EGFR dans le cancer du poumon sous l'effet des effets thérapeutiques. Dans 24% des cas, des mutations somatiques du gène EGFR ont été détectées dans le tissu tumoral des patients, dont deux étaient nouvelles. La mutation la plus fréquente de L858R dans les pays européens ne s'est produite qu'une seule fois. Les patients présentant des mutations ont reçu un traitement au géfitinib (iressa).

Lorsqu'ils ont été observés pendant 1,5 an, tous les patients présentant une mutation du gène EGFR ont survécu, tandis que dans le groupe sans mutations, la survie était faible.
D'après les résultats obtenus, la nécessité de déterminer les mutations du gène EGFR dans le cancer du poumon s'ensuit pour augmenter l'efficacité du traitement de cette maladie. Pour augmenter l'efficacité du traitement et minimiser les effets secondaires, non seulement les changements dans le génome de la cellule subissant une tumeur maligne, mais aussi les caractéristiques héréditaires des gènes sont importants.

En particulier, les variantes polymorphes déterminées par nous dans le gène CYP2D6 sont associées à la réponse au tamoxifène dans le cancer du sein, la variante du gène UGT1A1 * 28 est associée au degré d'effets hématoxiques lors de l'utilisation de l'irinotécan.

Une lignée distincte dans cette série sont les gènes suppresseurs d'une prédisposition héréditaire au cancer. Dans ce sens, nous avons révélé les spectres et les fréquences de mutation des gènes suppresseurs caractéristiques des patients russes, le diagnostic génétique d'une prédisposition héréditaire aux principales localisations socialement significatives du cancer a été développé. Cependant, les mutations héréditaires dans un certain nombre de gènes suppresseurs sont également importantes pour la sélection et la prédiction de l'efficacité des agents de chimiothérapie. Des exemples de cette dépendance sont donnés dans le tableau. 1.

Tableau 1

Mutations dans les gènes suppresseurs de cancer et les thérapies



Petit ARN interférant dans l'induction efficace de l'apoptose des cellules cancéreuses. Un exemple de la relation entre les différentes caractéristiques structurelles du génome des cellules cancéreuses et la fonction des gènes de la voie de signalisation est l'analyse suivante. Nous avons étudié les effets de la suppression de la manifestation fonctionnelle de certains gènes à l'aide de petits ARN interférents (siRNA) dans des lignées cellulaires PTK: NT-29 et CaCO2. Une caractéristique essentielle de la lignée NT-29 est la présence d'une mutation dans le gène APC, qui est également une cause héréditaire de ce cancer. Dans la lignée cellulaire CaCO2, il n'y a pas de mutation dans le gène APC. Conformément à cela, nous avons constaté que l'expression du gène c-Myc dans les cellules HT-29 est environ 5 fois supérieure à celle dans les cellules CaCO2. Après transfection des cellules siRNA et suppression de la fonction du gène c-Myc, une apoptose a été observée dans les cellules HT-29 (17%, c'est 3 fois plus par rapport au contrôle). La suppression du gène c-Myc dans la culture de CaCO2 n'a pas conduit à une différence significative du nombre de cellules apoptotiques par rapport au contrôle. Lors de l'induction de l'apoptose par choc thermique (44 ° C, 40 min), la suppression du gène c-Myc a entraîné une augmentation du nombre de cellules apoptotiques. Dans le même temps, l'effet apoptotique après un choc thermique était plus prononcé lorsque l'ARNsi inhibait la fonction du gène HSPA5 (un représentant de la famille des protéines de choc thermique 70, HSP70) dans les deux lignées cellulaires par rapport à l'effet de la suppression du gène c-Myc.

La suppression simultanée des gènes ci-dessus a conduit à l'apoptose de 90% des cellules de la culture NT-29 et de 60% des cellules CaCO2, ce qui dépasse considérablement l'effet du choc thermique sans suppression de ces gènes. Les données obtenues démontrent un effet différent de la suppression de l'activité des mêmes gènes dans les cellules cancéreuses en fonction des changements structurels de leur génome, ainsi que de l'importance des gènes étudiés pour le développement de méthodes de traitement de la PTK, en particulier les tumeurs associées aux mutations du gène APC.

Une étude a été réalisée pour stimuler l'apoptose du cancer letki en supprimant l'ARN exprimé d'un certain nombre de gènes. Le knockdown des gènes a été réalisé en utilisant des micro-ARN (siRNA) 19-22 paires de bases ARN à boucle longue et courte (shRNA) exprimés dans le cadre des vecteurs. L'augmentation de l'effet apoptotique des agents chimiothérapeutiques et l'apoptose spontanée résultant de la suppression des gènes sur les lignées cellulaires du cancer du côlon ont été déterminées. Une série d'expériences répétées a été réalisée sur l'interférence ARN des inhibiteurs de l'apoptose (IAP) impliqués dans le cycle de la caspase. À la suite de ces travaux, il a été démontré que l'expression conjointe de shRNA anti-IAP-2 et FLIP à de faibles doses d'oxaliplatine donne un effet comparable avec un dosage séparé en 3 fois (LD40) d'oxaliplatine. Un «cocktail» de shRNA (anti-IAP-2 et FLIP) et de siRNA (anti-IAP-5 et HspA5) conduit à la mort des cellules apoptotiques, dont le nombre est 2 fois le nombre de cellules apoptotiques sous l'action de l'oxalylplatine du dosage ci-dessus. Différentes combinaisons de siRNA et shRNA avec une dose LD40 d'oxaliplatine entraînent une mort cellulaire apoptotique de 68% par rapport au standard 10% dans le contrôle négatif et 18% pour la LD40 d'oxaliplatine. Les données obtenues démontrent que les ARN interférents des inhibiteurs de l'apoptose peuvent être considérés comme un outil prometteur pour le développement de nouvelles thérapies contre le cancer, ainsi que pour améliorer l'effet thérapeutique provoqué par la chimiothérapie standard et réduire sa charge sur le corps du patient.

Processus fonctionnels dans le microenvironnement tumoral. Récemment, le nombre croissant de données sur l'influence du microenvironnement sur les processus de nucléation et de développement d'une tumeur maligne. Par exemple, il a été démontré que les changements dans l'expression des gènes de la voie de signalisation du hérisson associés au développement du cancer dans un certain nombre de tissus ne se produisent pas dans les cellules cancéreuses elles-mêmes, mais dans le tissu adjacent (Yach et al., Nature, 2008, V. 455, P. 406-410 ) Ces données sont considérées comme importantes pour le développement de nouvelles thérapies contre le cancer (Curran et Ng., Nature, 2008, V. 455, P. 293-294). Nous avons étudié l'expression des gènes BRCA1 et BRCA2, ainsi que le récepteur aux œstrogènes (ER) dans divers échantillons de tissu ovarien: une tumeur cancéreuse adjacente à une tumeur tissulaire saine et un tissu éloigné de la tumeur.

Le niveau d'expression génique de ces gènes a été déterminé en utilisant la PCR en temps réel. Il a été constaté que dans un tiers des cas étudiés, l'expression du gène ER était maximale dans le tissu adjacent à la tumeur par rapport à l'expression dans la tumeur cancéreuse et dans le tissu normal. L'expression du gène BRCA1 dans une tumeur cancéreuse ovarienne relativement éloignée de la tumeur a été réduite dans la majorité des cas.

La diminution de l'expression du gène BRCA1 dans la tumeur est statistiquement significative, ce qui n'est pas observé pour le gène BRCA2. Les résultats obtenus correspondent au rôle du gène BRCA1 dans la forme héréditaire du cancer de l'ovaire et indiquent son importance dans le développement de la forme sporadique de cancer de cette localisation.

Dans l'environnement proche de la tumeur, l'expression du gène BRCA1 a été réduite par rapport à l'expression dans la tumeur dans 67% des cas. Dans les mêmes échantillons, le rapport de l'expression du gène BRCA2 dans la tumeur et à proximité de l'espace tumoral était inverse par rapport à l'expression du gène BRCA1.

Les résultats démontrent pour la première fois la relation de l'expression des gènes suppresseurs BRCA1 et BRCA2 dans les tissus de la tumeur maligne et dans l'espace tumoral proche. Le phénomène découvert indique la relation des processus fonctionnels dans une tumeur cancéreuse et dans les tissus environnants et, compte tenu du rôle suppresseur et régulateur des gènes BRCA1 / 2, leur importance pour le développement du cancer.

Les données obtenues sont importantes pour comprendre l'interaction d'une tumeur et de son microenvironnement et peuvent être utilisées dans le développement de nouvelles méthodes pour le traitement du cancer de l'ovaire.
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CARACTÉRISTIQUES STRUCTURELLES ET FONCTIONNELLES DES GÈNES DANS LE DIAGNOSTIC ET LE TRAITEMENT DU CANCER

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