Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions

R.V. OIMPSON et V.D. BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.)



I. INTRODUCTION

Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, à propos de laquelle la plupart des informations sont fragmentaires dans sa composition du si comprend un grand nombre de questions non résolues. La principale affirmation sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus à génome négatif (Barry, Mahy, 1973), c'est-à-dire des virus qui incluent nécessairement de l'ARN polymérase. Cette enzyme transcrit à partir de la matrice du génome fragmenté du virus les molécules d'ARN complémentaires, qui sont des ARN messagers pour la synthèse des protéines virales. La division du matériel en deux parties, d'une part, une description des données sur l'ARN polymérase des cellules infectées et, d'autre part, sur l'ARN polymérase des particules virales purifiées, est dictée simplement par commodité et ne doit pas être interprétée comme une confirmation du point de vue selon lequel ces deux systèmes fonctionnent avec deux enzymes différentes.

II. ACTIVITÉ ARN POLYMÉRASE DANS DES CELLULES INFECTÉES

Pour la première fois, l'activité dépendant de l'ARN de l'ARN polymérase des cellules infectées par le virus de la grippe a été découverte par Ho et Walters (1966) sur les membranes homogénéisées chorion-allantoïdiennes de poulets infectés (virus de la grippe. L'actinomycine D, contrairement au chlorhydrate de guanidine, a inhibé cette activité. - ont été obtenus par plusieurs laboratoires, dont l'accent était principalement mis sur les différentes exigences du système, les aspects temporels de l'apparition de l'enzyme et la nature des produits obtenus (Rage et al., 1968; Skehel, Burke, 19 68; Ruck et al., 1969; Scholtissek et al., Rott, 1969a) Une observation intéressante a été faite précédemment que l'infection des cellules par le virus de la peste aviaire (FPV) s'accompagne d'un effet prononcé sur l'activité polymérase de la cellule hôte (Borland, Mahy, 1968) Dans cet ouvrage et un certain nombre de travaux ultérieurs (Mahy, 1970; Mahy et al., 1972, 1974), l'activité de la polymérase a été étudiée à la fois dans les nucléoles (polymérase I) et dans le nucléoplasme (polymérase II) trouvés dans la fraction des noyaux purifiés isolé de cellules de fibroblastes d'embryons de poulet infectés. L'activité des polymérases différait en sensibilité à la fois à la composition ionique du milieu et à l'action de l'a-amanitine. Il a été démontré que l'activité insensible à l'action de l'α-amanitine (polymérase I) diminue après l'infection par le virus, tandis que la polymérase II, sensible à cet agent, est apparemment responsable de la synthèse de l'ARN cellulaire d'information (Roeder, Rutter, 1970; Zyller, Penman, 1971; Roeder, Roeder, 1972), augmente son activité à une valeur 70% supérieure à l'activité de la polymérase dans les cellules non infectées (Mahy et al., 1974). L'augmentation de l'activité de la polymérase II dans les noyaux isolés correspond à la première des deux périodes clairement distinctes d'augmentation de la synthèse d'ARN dans les cellules β infectées, observées à l'aide de la méthode de marquage radioactif par impulsions après 0,90 min et 3 h après le début de l'infection. Seule la première de ces deux augmentations d'activité était sensible à l'a-amanitine, administrée 1 heure avant le pouls. Étant donné que l'a-amanitine est connue pour bloquer la réplication du virus de la grippe (Rott, Scholtissek, 1970, Mahy et al., 1972), et puisque les conditions de mise en œuvre de l'activité de l'ADN sont remplies (voir Chap. VIII), les données ci-dessus indiquent probablement utilisation de l'hypothèse qu'un (ou plusieurs) type d'ARNm de la cellule hôte est nécessaire pour la réplication aux premiers stades de la reproduction du virus de la grippe.

A. ACTIVITÉ DES ENZYMES DANS DIVERSES FRACTIONS CELLULAIRES ET EXIGENCES POUR LE SYSTÈME DE TEST IN VITRO

Les résultats de diverses études sur la nature de l'activité polymérase induite par le virus dans les cellules infectées par le virus de la grippe sont fondamentalement similaires. Dans la majorité des travaux, l'activité de la polymérase est détectée dans les fractions microsomales 1 à 2 heures après le début de l'infection (No, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). De plus, dans tous les cas, l'activité enzymatique est dépendante de l'ARN, se produit sur la matrice endogène (Schwarz, Scholtissek, 1973) et est insensible à l'action de l'ARN exogène, de la désoxyribonucléase ou de l'actinomycine D (tableau D5).

L'activité de l'ARN polymérase spécifique du virus associée aux cellules infectées a été détectée avec certitude dans les fractions cellulaires isolées, y compris les éléments microsomiques du noyau, et n'a pas été détectée dans le saké cellulaire, généralement le surnageant de l'homogénat cellulaire après ultracentrifugation (Scholtissek, Rott, 1969a).

Les réactions de polymérase in vitro courantes catalysées par une enzyme cellulaire sont le besoin des quatre nucléosides triphosphates (Ruck et al., 1969), un optimum de température à 28 ° C (Paffenholz, Scholtissek, 1973) et une cinétique de réaction linéaire pour au moins la première Incubation de 2 heures. Il convient de noter que, puisque la réaction in vitro est maintenue pendant une période maximale à 28 ° C, l'incubation du mélange réactionnel à des températures plus élevées (c'est-à-dire dans des conditions se rapprochant des conditions optimales pour la réplication virale in vivo) conduit à un taux plus élevé Synthèse d'ARN suivie d'une forte baisse d'activité, entre 30 et 60 minutes après l'infection (Paffenholz, Scholtissek, 1973). L'effet indiqué peut être associé à l'instabilité du complexe enzyme-substrat à une température de réaction in vitro supérieure à optimale (cette question sera discutée ci-dessous pour la virion polymérase de la grippe).

Il existe encore des opinions contradictoires dans la littérature sur la dépendance de la réaction in vitro catalysée par une enzyme cellulaire ou virion sur (la présence de divers cations .. Il y a des rapports sur la nécessité pour Mn2 + et iMg2 + ou l'un de ces ions d'exister dans le milieu réactionnel. Différentes conclusions dans ce cas. Différentes conclusions dans ce cas. Cela s'explique probablement par la différence dans le choix du système virus-cellule, la méthode de purification utilisée et la concentration réelle des ions présents dans le mélange réactionnel. Le tableau 16 résume les résultats obtenus en étudiant l'effet des ions activité de la lolase cellulaire Récemment, Horrisberger et al. (Horrisberger, Guskey, 1974; Horrisberger, Schulze, 1975) ont montré que l'activité in vitro de l'ARN polymérase peut être détectée dans la fraction surnaturelle mitochondriale du lysat de cellules infectées par la souche A0 / NWS du virus de la grippe. en présence de Mn2 + ou Mg2 + dans le mélange réactionnel, l'addition de KS! au milieu réactionnel stimule la synthèse d'ARN en présence de Mn2 + et l'inhibe en présence de Mg2 + uniquement. Il existe plusieurs explications à ce phénomène, en particulier l'affirmation de la présence de deux enzymes dans le système, dont le fonctionnement nécessite la présence d'ions différents (Horrisberger, Guskey, 1974). Ce point de vue est également confirmé par la réaction de la polymérase, en présence de Mg2 +, qui a une vitesse initiale plus élevée et est inhibée après 20 minutes, tandis que la réaction stimulée par la présence de Mn2 + seulement se maintient pendant au moins 2 heures. Il est clair que pour prouver la validité les hypothèses de présence de deux enzymes nécessitent des recherches plus poussées.

B. COMPRENDRE LA NATURE DES PRODUITS D'ARN SYNTHÉTISÉS IN VITRO À L'AIDE DE FACES DE CELLULES INFECTÉES AVEC UNE ACTIVITÉ POLYMÉRASE

Comme nous le verrons plus en détail ci-dessous (voir chap. 8), l'infection de cellules permissives de myxovirus conduit à la synthèse d'ARN spécifiques au virus en eux, représentant toutes les classes de tailles d'ARN du génome viral purifié. L'ARN de type virion a été trouvé principalement dans la fraction RNP du cytoplasme et du nucléoplasme, tandis que les molécules complémentaires à l'ARN viral ont été trouvées dans la fraction RNP mineure du cytoplasme (Pons, 1971; Krug, 1972) et, probablement, au moins pour la plupart, des molécules associées aux polysomes (Nayak, 1970; Pons, 1972). Une petite quantité d'ARN double brin a été trouvée, ce qui correspondait également à toutes les classes de tailles différentes d'ARN de virion, mais le rôle réel de cet ARN dans la biosynthèse du virus est encore inconnu (Pons, 1967; Pons et Hirst, 1968). Contrairement au système in vivo, l'identification des produits d'ARN synthétisés in vitro avec la participation d'une enzyme cellulaire est une question ouverte. Dans plusieurs laboratoires (Ruck et al., 1969; Skehel, Burke, 1969; Ma-hy, Bromley, 1969), une synthèse moléculaire a été rapportée

ARN 10S et 12S résistants à la ribonucléase dans des mélanges réactionnels catalysés par des fractions microsomales de cellules infectées. Ces molécules, selon certains chercheurs, sont les précurseurs de formes simple brin (Mahy, Bromley, 1969). Il y a beaucoup moins de certitude à établir le type d'ARN simple brin synthétisé dans ces conditions. Sur la base d'une analyse comparative des produits de synthèse à l'aide d'une macro des membranes chorion-allantoïdiennes d'embryons de poulet infectés (souche A / Leningrad / 62 (H2N2), Ruck et al. (1969) ont montré que les ARN synthétisés in vitro ont un nucléotide une composition similaire à la composition nucléotidique de l'ARN virion, mais selon Scholtissek (1969), de 85 à 100% du produit synthétisé dans un système in vitro contenant des fractions microsomales de cellules embryonnaires de poulet prises 6 heures après l'infection par le virus FPV pourrait -être spécifiquement gibrddizo-vans avec ARN de virion homologue En utilisant le même système virus-cellule aux stades précoce et tardif de l'infection, Hastie et Mahy (1973) ont pu montrer que le produit de l'ARN polymérase microsomale obtenu in vitro contenait de 67 à 93% de 1 ARN complémentaire dans en fonction du moment de l'extraction de la cellule, en utilisant une méthode d'hybridation appropriée, ces auteurs ont également constaté que les noyaux purifiés des cellules ci-dessus synthétisent de l'ARN viral et complémentaire en quantités approximativement égales. Cette activité nucléaire de la polymérase se produit plus tôt qu'elle n'est détectée dans les fractions cytoplasmiques. Les données décrites montrent que les informations contradictoires dans la littérature sur les différentes classes d'ARN simple brin synthétisées in vitro par une enzyme qui se produit dans la cellule en réponse à une infection par le virus de la grippe peut s'expliquer par le fait que les cellules ont été sélectionnées pour déterminer l'activité de la polymérase à différents moments après l'infection , et le fait que cette activité a été étudiée dans différentes fractions de cellules.

III. ACTIVITÉ ARN POLYMÉRASE ASSOCIÉE À VIRION

La présence signalée de particules d'ARN purifiées d'activité d'ARN polymérase ARN-dépendante (Shatkin, Sipe, 1968; Borsa, Graham, 1968) a suivi la découverte de virion transcystase dans les rhabdovirus (Baltimore et al., 1970), virus tumorigènes contenant de l'ARN ( Te-min, Mitzutani, 1970; Baltimore, 1970) et les paramyxovirus (Huang et al., 1971). Les premières tentatives pour détecter une telle activité enzymatique dans la souche WSN du virus de la grippe,

entreprises dans notre laboratoire ont échoué car le système de test in vitro nécessitait une composition ionique spéciale du milieu. L'introduction de Mn2 + dans le mélange réactionnel nous a permis de détecter l'activité β-positive de l'ARN polymérase dans certaines souches du virus de la grippe (Chow et Simpson, 1971). Cette observation a été rapidement confirmée dans d'autres laboratoires (Penhoet et al., 1971; Ske-hel, 1971). En comparant l'activité virion de l'ARN polymérase du virus de la grippe avec l'activité de la lolymérase d'autres virus, il convient de noter que la transcriptase du virus de la grippe est environ 750 fois moins active que la transcriptase du virus de la stomatite vésiculeuse et du réovirus, respectivement (tableau 17). En revanche, le virus grippal de la souche A0 / WS est environ 4 et 20 fois plus actif que le virus du virus Nkzhaetta et le virus Sendai. Les réovirus diffèrent des autres virus animaux contenant de la transcriptase virale en termes à la fois de leur activité élevée en ARN polymérase et de leur capacité à induire la transcription dans le système in vitro (Skehel et Joklik, 1968).

A. CARACTÉRISTIQUES DU SYSTÈME IN VITRO

La composition complète du mélange réactionnel nécessaire pour observer l'activité de l'ARN polymérase des variations de la grippe in vitro est fondamentalement similaire à la composition utilisée dans l'étude de la tranécriptase d'autres virus animaux enveloppés. Le mélange doit contenir de la virioia sous forme purifiée, les quatre nucléosides triphosphates, un détergent approprié (qui, apparemment, est nécessaire pour rendre le complexe polymérase - ribonucléoprotéine accessible), des ions monovalents et divalents en concentrations, qui seront discutés ci-dessous. La température optimale pour la synthèse continue d'ARN polymérase dans le système in vitro est de 31 à 33 ° C (Bishop et al., 1971a); je diffère de la température optimale pour la croissance du virus dans les cellules (Scholtissek et Rott, 1969b). Cet effet est probablement associé à l 'instabilité du complexe polymérase - matrice dans le système in vitro à des températures élevées.

L'effet de divers cations sur la synthèse de produits d'ARN, réalisée en utilisant la virion transocritase dans le système in vitro, a été étudié par plusieurs groupes de recherche. Dans leurs travaux sur cette réaction enzymatique, Chow et Simpson (1971), Penhoet et al. (1971) ont rapporté que la présence de Mn2 + dans le système est nécessaire pour que l'activité de la transcriptase se produise. Les deux groupes de chercheurs ont déterminé la concentration minimale requise de ces ions - 1,9 et 4 mm, respectivement. Si, dans le mélange réactionnel, Mn2 + est remplacé par Mg2 +, la synthèse d'ARN se déroule à un niveau fortement réduit (Chow et Simpson, 1971; Skehel, 1971), bien que la présence d'ions Mg2 + dans le système conserve une activité enzymatique élevée à une concentration de Mn2 + inférieure à l'optimum (Bishop et al., 1971a). En relation avec ces observations, on peut conclure que Mn2 + est un cation divalent nécessaire au fonctionnement de la virion polymérase grippale dans le système in vitro.

L'activité transacriptase des particules du virus de la grippe, ainsi que l'inhibition de l'élimination in vitro des ingrédients nécessaires à la réaction du système réactionnel, est également inhibée par la ribonucléase et les polyanions (Chow et Simpson, 1971). Aucune inhibition n'a été observée lorsque l'actinomycine D, la rifampicine, l'a-amanitine et l'ADNase ont été introduites dans le système (Chow, Simpson, 1971; Penhoet et al., 1971; Skehel, 1971). Cependant, comme cela sera noté ci-dessous, l'actinomycine D semble supprimer l'activité de transcription due aux enzymes virions dans les cellules infectées à ses premiers stades (voir le tableau 15). Oxford et al., À l'aide d'un système de transcriptase virale in vitro, ont montré un effet inhibiteur sur la sélénocystamine, les dérivés de phén-nantrolène et les thiosemicarbazones, ainsi que tous les composés qui sont des chélates forts pour les métaux lourds «mous» tels que le zinc (Oxford , 1973a; Oxford, Perrin, 1974). L'inhibition de l'activité d'une enzyme associée à une cellule avec la sélénocystine a été décrite précédemment (Ho et al., 1968; Ho, Walters, 1971). Le fait que la virion transcriptase peut être une enzyme métallique contenant du zinc, similaire à l'ARN cellulaire ou à l'ADN polymérase d'E. Coli (Scrutton et al., 1971; Slater et al., 1971), est indiqué par la présence de zinc dans les particules purifiées du virus de la grippe. , qui a été montrée à l'aide de méthodes de sorption atomique a-b et de spectroscopie de masse atomique (Oxford et Perrin, 1975). Il est important, en outre, de noter à cet égard que le zinc fait partie de l'ADN polymérase ARN-dépendante des virus de l'oncorn (Auld et al., 1974) Récemment, un effet stimulateur sur la synthèse d'ARN catalysée par les virions a également été trouvé polymérase dans le système in vitro, facteurs hôtes d'origine cellulaire (Rochavansky, communication personnelle) L'un de ces facteurs a été précédemment identifié comme pyrophosphatase inorganique, car cette enzyme, une fois purifiée, ainsi que des extraits de cellules normales de l'embryon de poulet, ont été stimulées environ 2 fois l'activité de l'ARN polymérase du virus de la grippe et a supprimé l'effet inhibiteur du phosphate exogène ajouté au mélange réactionnel. L'identification d'un autre facteur de la cellule hôte, qui semble également stimuler la transcription dans le système in vitro, est actuellement en cours.

B. PRODUITS DES RÉACTIONS DE L'ARN VIRION POLYMÉRASE

La réaction catalysée par les virions grippaux est linéaire aux premiers stades et sa vitesse est proportionnelle à la quantité de protéine virale utilisée dans le système de test. L'extraction d'ARN synthétisé dans ces conditions en utilisant du phénol et son traitement ultérieur avec un mélange de rnbonucléase I et Ti a révélé que 60 à 80% du produit de la réaction de la polymérase était résistant à la ribouclease (Bishop et al., 1971). La plupart des produits de réaction sensibles à la RNase restants peuvent être convertis en la forme résistante à la RICase en utilisant l'auto-hybridation de l'ARN dans le système de test total. Analyse de cet ARN par électrophorèse en poly

le gel d'acrylamide lors de l'utilisation de précurseurs de matrice et de produits de réaction marqués avec différents marqueurs radioactifs, indique une synthèse aux premiers stades de la migration de l'ARN dans le gel en parallèle avec l'ARN de la matrice du virion, y compris toutes les classes de taille et, en outre, un peu. poids moléculaire des fragments (Bjshop et al., 1971b). Ces derniers produits de réaction peuvent être convertis (sous des formes avec une mobilité d'électrophorèse plus élevée, et avec un poids moléculaire dans la gamme de 5–10–3 –10–5 en chauffant l'ARN à 100 ° C. Conclusion générale sur l'ARN synthétisé par la transcriptase virion du virus de la grippe, qui peut être faite sur la base des expériences décrites, elle consiste dans le fait que la - grande partie du produit synthétisé in vitro est de l'ARN complémentaire, qui, apparemment, est lié à la matrice au moyen de liaisons hydrogène avec formation de complexes multibrins de nature encore peu claire ы. В настоящее время нет доказательств быстрого вытеснения комплементарных низкомолекулярных цепей из этих комплексов во время процесса транскрипции, как это было показано на модели рабдовирусов, таких, как VSV (Bishop, Roy, 1971).

Инициаторная последовательность РНК-полимеразного продукта в системе in vitro -была определена Hefti и соавт. (1975).
Они изолировали рнбонуклеопротеиновый (Компонент из вирионов гриппа штамма WSN и пометили 5'-конец транс-криптазного продукта, синтезированного в системе in vitro, содержащей -у-меченные нуклеозадтрифосфаты. Была найдена в основном только одна инициаторная последовательность — pppGpCp. Несмотря на вывод авторов о том, что транскрипция может начинаться с этой уникальной последовательности, не 'был решен вопрос, каждый ли фрагмент генома вируса гриппа транскрибируется в этой системе. Недавно McGeoch и Kitron (1975) сообщили, что добавление гуано-зина в полимеразную систему стимулирует синтез РНК, комплементарной и вирионной. При условиях реакции, имя использованных, гуанозин включался в б'-конец последовательности GpCp. Стимулирование вирионной транскриптазы было получено также с помощью гуанозин-б'-монофосфата и ди-нуклеотидов GpC и GpG.

В. ВИРИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ТРАНСКРИПТАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ШТАММАХ ВИРУСА ГРИППА

В первом сообщении о наличии в составе частиц вируса гриппа РНК-полимеразы указывалось о штаммовых различиях активности транскриптазы в миксовирусах человека и животных в системе in vitro (Chow, Simpson, 1971). Дальнейшие исследования (Bean, 1974) привели к выводу, что на

наблюдаемое различие в активности транскриптазы некоторых штаммов вируса гриппа сильно влияет относительная чувствительность реакции к температуре инкубации. На 23 приведена кинетика реакции в системе in vitro вируса гриппа штамма WS и его дочернего штамма WSN. Эти вирусы отличаются по своим начальным скоростям синтеза как при оптимальной, так и при повышенной (37 °С) температуре. У вируса гриппа штамма WS начальная скорость синтеза всегда выше при 37 °С, а для вируса гриппа штамма WSN наблюдается обратная зависимость. При исследовании вирионной активности полимеразы режомбинантов штаммов WS и WSN было показано, что такие признаки, как предельная скорость реакции и отношение скоростей реакции при двух указанных температурах тест-системы пересортируются в потомстве, являющемся гибридными частицами по другим генетическим маркерам, совершенно независимо. Неизвестно, отражают ли эти свойства системы in vitro относительную физическую стабильность транскриптазного комплекса в целом или же стабильность его составных частей, в частности РНК-полимеразы. Недавно в нашей лаборатории были исследованы на наличие вирионной активности полимеразы в системе in vitro условно-летальные температуре чувствительные (ts) мутанты вируса гриппа штамма WSN, которые принадлежали к семи различным рекомбинационно-комплементаци-онным группам (Hirst, 1973). Все эти вирусы обладали сниженной активностью ферментов по сравнению с вирусом дикого типа и только один из мутантов (WSNts24) имел активность лишь «а 5% ниже, чем у WSN. Мы не смогли найти корреляции между необычной активностью транскриптазы таких мутантов и их специфическим температурочувствитель-ным дефектом (или дефектами). При исследовании активно-

ста транскриптазы -в вирионах пяти штаммов вируса FPV — представителей различных комллементационных групп — в реакционных смесях при лермисеивных и непермиосивных для роста (вируса температурах (36° л 42 °С соответственно) было показано, что один мутант снизил свою ферментативную активность на 71 %, в то время /как другие вирусы и их родитель дикого типа снизили свою активность при переходе к более высоким температурам лишь на 8—20% (Ghendon et al., 1973). Ни для одного из этих мутантов FPV не было обнаружено ассоциированной с вирусом лолимеразы, которая была бы -нефункциональна в «летках, инкубированных при температурах, исключающих репликацию вируса (для сравнения см. гл. 7). Однако Scholtissek и соавт. (1974) недавно описали ts-мутант FPV, который терял способность вызывать значительный вируоспецифический синтез РНК в клетках, инкубированных при нелермиосивной температуре, несмотря на то что микросомальная РНК-полимеразная активность обнаруживалась в экстрактах этих клеток в реакционных смесях в системе in vitro при температуре 40 °С, когда синтез вируса не имел места. Авторы не смогли объяснить причину наблюдаемого в этом случае несоответствия между функциональной активностью РНК-'Полимеразы вируса гриппа в двух описанных системах.

Доказательство различий в РНК-зависимой РНК-лолиме-разе гетерологичных серотипов вируса гриппа приведено в работе Scholtissek и соавт. (1971). Было показано, что кон-валесцентлая сывороша цыплят, инфицированных FPV, ин-гибировала активность микросомальной РНК-полимеразы, выделенной из клеток, зараженных либо гомологичными, либо гетер о логичными микровирусами А, но не обладала таким свойством при инфицировании клеток вирусом триппа В или парамиксовирусом NDV. Эти данные были рассмотрены как дополнительный аргумент в пользу того, что РНК-полимераза вируса гриппа по крайней мере частично кодируется вирусным геномом. В связи с тем что ранее исследования транскриптазы вируса гриппа проводились в основном на штаммах A, Oxford (1973) недавно провел исследование двух штаммов вируса гриппа В. Эти исследования показали, что вирусы данного типа также могут различаться по активности РНК-полимеразы в системе in vitro.

Г. АКТИВНОСТЬ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В СИСТЕМЕ IN VITRO НЕПОЛНОГО ВИРУСА И СУБВИРУСНЫХ КОМПОНЕНТОВ

Выполненные ранее в других лабораториях исследования продемонстрировали, что неполные или дефектные частицы вируса гриппа (фон-магнусовский тип), продуцируемые в результате нескольких пассажей при высокой множественности

заражения в подходящей хозяйской системе, содержат неполный набор вирионной РНК и обладают сниженной инфек-ционностыо (von Magnus, 1954; Ada, Perry, 1956; Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969). Недавно мы лровели исследование активности РНК-полимеразы препаратов фон-магнусовского вируса гриппа (Bean, 1974; Bean, Simpson, 1975), учитывая, что неполные Т-частицы некоторых рабдовирусов, как было показано ранее, теряли свою транакриптазную активнсгть (Roy, Bishop, 1972; Reichman et al., 1974). Мы обнаружили, что неполные частицы вируса гриппа А (штаммов WS или WSN), которые обладали в 10 000 раз более низкой инфек-ционностыо, чем нормальные частицы, и которые обладали дефицитом, как было установлено ранее Pons и Hirst (1969) и Duesberg (1968), высокомолекулярных фрагментов вирионной РНК, снизили свою транскриптазную активность в системе in vitro по крайней мере в 2 раза. Поскольку ранее было показано, что все классы вирусного нуклеопротеида имеют хорошо выраженную активность РНК-лолимеразы (Bishop et al., 1972), можно ожидать, что неполные частицы вируса гриппа будут тем не менее обладать каталитической активностью в транскрилтазной реакции в системе in vitro, несмотря на свою неполноценность. В связи с этим интересно отметить, что можно лолучить дефектные частицы вируса гриппа, которые, по-видимому, обладают нормальным набором фрагментов РНК, но имеют пониженную в 20 раз инфвкционность (Pons, Hirst, 1969). В нашей лаборатории было показано, что ни максимальное снижение наибольшего по размерам фрагмента вирионной РНК (приблизительно на 2/3), ни некоторое снижение активности лолимеразы в вирионе, вероятно, не являются причиной намного большего по величине уменьшения инфекционности популяции неполного вируса. Все вместе эти факты указывают на то, что сниженная инфекционность этих вирусных частиц объясняется другими, неясными в настоящее время, причинами.

Д. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСНОГО ПОЛИПЕПТИДА, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА АКТИВНОСТЬ ТРАНСКРИПТАЗЫ

В настоящее время остались невыясненными два вопроса, связанных с идентификацией структурного полипелтида (или полипептидов), ответственного за активность транскриптазы вириона, вируса гриппа и механизм взаимодействия этого полипептида с ферментом, ассоциированным с клеткой. В составе белков фракции рибояуклеопротеида диссоциированных вирусных частиц штамма WS, обладающего активностью транскриптазы, находится в основном белок NP (относительная молекулярная масса «^55 000) и следы высокомолекулярного полипептида Р (относительная молекулярная масса си 90 000) (Bishop et al., 1972). Недавние исследования рибо-

нуклеопротелда, полученного из штамма WSN, подтвердили эти результаты и, кроме того, показали, что компоненты Pi и Р2 высокомолекулярных белков входят в состав фракции, обладающей активностью транскриптазы (Rochovansky, персональное сообщение). Было обнаружено, что как из очищенных частиц вируса гриппа, так и из микросомальной фракции инфицированных вирусом .клеток могут быть изолированы компоненты нуклеокапсида, обладающие активностью полимеразы и идентичные как -морфологически, так и по плавучей плотности. Этот факт является сильным аргументом в пользу того, что описанные ассоциированные с клеткой структуры физически эквивалентны транскрибирующему комплексу, обнаруживаемому в ннтактных вирионах (Compans, Caliguiri, 1973). Хотя вначале было сообщено, что компоненты вирусного нуклеокапеида, обладающие активностью транскриптазы и выделенные из инфицированных вирусом гриппа клеток, содержат только белок NP (Compans, Caliguiri, 1973), те же исследователи позднее обнаружили в аналогичных фракциях полипептид Р. Авторы использовали соответствующую технику радиоактивной метки, необходимую для обнаружения этого белка, который, вероятно, синтезируется на очень ранних этапах инфекционного цикла (Caliguiri, Compans, 1974). До сих пор все попытки отделить мик-росомальную лолимеразу от внутренней матрицы и получить фермент, функционирование которого связано с добавлением экзогенной РНК, были неудачными (Schwarz, Scholtissek, 1973). Отрицательный результат проводимых до настоящего времени попыток изолировать ферментативно-активную по-лимеразу может быть связан с необратимым разрушением самого вирусного фермента или с абсолютной необходимостью присутствия интактного рибонуклеопротеида в качестве функциональной матрицы. Подобным образом методы, .которые с успехом использовали для уничтожения и 'восстановления активности транскриптазы вириона, ассоциированной с нуклеопротеидом рабдовирусов (Bishop et al., 1974), не дали результата при изучении очищенных вирусов гриппа (Bishop, персональное сообщение). В конечном счете идентификации вириояной и клеточной РНК-лолимеразы и выяснению того, насколько для их работы необходимо присутствие матрицы, должно предшествовать успешное осуществление дальнейших попыток выделить эти ферменты в функционально-активном виде.

Е. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТРАНСКРИПЦИИ ВИРУСА ГРИППА В ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ

Как неинфекционный характер генома вируса гриппа, так и присутствие в составе микоовирусов вирионной РНК-лолимеразы находят свое отражение в том, что первичным собы-

тием, происходящим в клетках, инфицированных вирусом гриппа, является транскрипция вирусной матричной РНК в комплементарную форму (Baltimore, 1971). В нашей лаборатории изучались эти процессы, имеющие место в инфицированных клетках, для того чтобы определить, насколько транскрипция вирионной РНК 'в системе in vivo с точки зрения кинетики реакции и чувствительности ее к действию различных ингибиторов сходна с ее транскрипцией в системе in vitro.

Как сообщили недавно Bean и Simpson (1973), можно проследить превращение меченной по 32Р 'вирионной матричной РНК в устойчивые к действию рибонуклеазы комплексы, которые образуются в результате ее гибридизации с вновь синтезируемыми нитями комплементарной РНК, присутствующей в гибридизационных смесях тотальной РНК, выделяемой через различное время .после инфицирования клеток радиоактивно меченным вирусом гриппа. Этот метод эффективен при наблюдении за синтезом комплементарной РНК в клетках до тех пор, пока через некоторое время после начала инфекции не будут синтезированы такие количества вирионной РНК, что она начнет конкурировать в гибридиза-ционной смеси с вводимой в систему меченой РНК- На 24 представлена кинетика синтеза комплементарной РНК 'в системе in vivo, проанализированная с помощью этого метода. Принципиальной особенностью транскрипции в оистеме in vivo, закономерности которой отражены на рисунке, является ее двухфазный характер. Концентрация продукта транскрипции, который обнаруживается в системе спустя 40—60 мин после начала инфекции, линейно увеличивается до отметки приблизительно 90 мин, затем происходит очень быстрый ее рост. Действие на транскрипцию in vivo таких соединений, как актиномицин D и циклогексимид, интересно в свете нх различного действия и ингибирования синтеза комплементарной и вирусной РНК соответственно (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Актиномицин D, добавленный в систему в момент начала инфекции, полностью ингибирует транскрипцию in vivo, в то время как циклогексимид не влияет на первоначальную (первичную) транскрипцию, но ингибирует ее вторичный подъем (см. 24). Если транскрипцию in vivo проследить в течение более длительного времени, как это показало на 25, то можно заметить, что количество устойчивых к действию рибонуклеазы РНК снижается после 3 ч инкубации.

Это явление мы связали с возникновением в 'клетке конкурирующих молекул вирионной РНК (Bean, Simpson, 1973). Если, однако, циклогексимид добавляли к клеткам после начала усиленной транскрипции, то такого снижения не происходило, вероятно, за счет селективного блокирования этим

соединением синтеза вирионных РНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Наоборот, добавление в систему антиномицинаD через 2 ч после начала инфекции .приводит к резкому спаду содержания устойчивой к действию РНК-азы РНК, возникающей после гибридизации суммарной клеточной РНК. Естественным объяснением этого эффекта является то, что актиномицин D преимущественно ингибирует синтез комплементарной РНК « не действует на образование дополнительной вирионной РНК, которая конкурирует с меченой матричной РНК во время гибридизации. Это объяснение 'было ранее предложено другими исследователями (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). В нашей лаборатории недавно были проведены исследования, посвященные действию других ингибиторов «а процесс транскрипции in vivo. В частности, было обнаружено, что транскрипция вируса гриппа в системе in vivo ингибируетея предварительной обработкой клеток куриных эмбрионов 'кордиеешгаом, а-аманитином, митомицином С, интерфероном и ультрафиолетовым излучением (Bean, Simpson, 1973; Bean, 1974). Очевидная необходимость присутствия

эндогенной функциональной хозяйской ДНК для инициации процесса транскрипции виршонов гриппа в пермиосивных клетках находит отражение в зависящем от дозы подавлении транскрипции in vivo в клетках, облученных до начала инфекции ультрафиолетовой радиацией.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, описанные в этой главе, могут служить стимулом для продолжения работы по изучению РНК-зависимых PiHK-полимераз миксовирусов и выяснению их роли в инфекционном процессе. Вопрос о том, играют ли фрагменты .комплементарной РНК, синтезируемые этим ферментом, непосредственную роль в синтезе вирусных белков, до сих пор не решен (Seigert et al., 1973; Kingsbury, Webster, 1973) н требует дальнейших исследований. Кроме того, в настоящее время еще не проведена химическая идентификация транскриптазы вируса гриппа, и должны 'быть предприняты

героические усилия для изоляции этого фермента в активном виде, чтобы привести его полную характеристику. Вероятно, самый запутанный вопрос, который ждет своего решения, — это вопрос о роли клетки-хозяина в инициации и осуществлении синтеза вир ионных РНК- Хотя актиномицин D и не оказывает заметного действия на активность вир иона и полиме-раз клетки в системе in vitro, это соединение, так же как ультрафиолетовое облучение >и другие ингибиторы активности клеточных ДНК, блокирует транскрипцию -в системе in vivo. Эти факты, а также невозможность обнаружить вирионные продукты в инфицированных 'безъядерных клетках (Follet et al., 1974; Kelley et al., 1974), указывают на то, что для транскрипции вируса гриппа необходимо функционирующее ядро. Однако наличие в системе in vivo первичной транскрипции в присутствии циклогексимида является дополнительным аргументом в пользу того, что для протекания транскрипции не требуется наличия трансляции 'вновь синтезированных мРНК. В настоящее время не выдвинуто какой-либо подходящей гипотезы, которая удовлетворяла бы всем этим запутанным данным. Вместе с большинством исследователей, изучающих эти интересные проблемы, мы надеемся, что можно будет более ясно понять, каким образом транскрипция вируса гриппа регулируется клеточными и вирусными факторами. Эти значения могут сильно помочь нам в разработке эффективных химиотераяевтических подходов для контроля за мвк-совирусной инфекцией человека и животных.



ЛИТЕРАТУРА

Aaslested HG, Clark HF, Bishop DHL, Koprowski HJ Virol.. 1971

Ada GL, Perry В. Т. J. gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Auld DS, Kawaguchi DM, Livingston DM, Vallee BL Proc. nat. Acad.

Sci. US, 1974, v. 71, p. 2091.

Baltimore D. Nature (London), 1970, v. 226, p. 1209. Baltimore D., Bacteriol. Rev., 1971, v. 35, p. 235. Baltimore D., Huang AS, Stampfer M. Proc. nat. Acad. Sci. US, 1970,

v. 66, p. 572. Barry RD, Mahy BWJ, eds. Negative Strand Viruses, New York, Acad.

Press, 2975. Bean WJ, Jr. Doctoral Dissertation, Rutgers, The State University of New

Jersey, New Brunswick, 1974.

Bean WJ, Jr., Simpson RW Virology, 1973, v. 56, p. 646. Bean WJ, Jr., Simpson RWJ virol. Submit, publ., 1975. Bishop DHL, Roy PJ mol. Biol., 1971, v. 57, p. 513. Bishop DHL, Obijeski JF, Simpson RWJ Virol., 1971a, v. 8, p. 66. Bishop DHL, Obijeski JF, Simpson RWJ Virol, 1971b, v. 8, p. 74. Bishop DHL, Roy P., Bean WJ, Jr., Simpson RWJ Virol., 1972

Bishop DH L, Emerson S. JJ., Flamand AJ Virol., 1974, v. 14, p. 139. Borland R., Mahy BWJJ Virol, 1968, v. 2, p. 33. Borsa /., Graham AF Biochem. biophys. Res. Commun., 1968
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа

  1. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
    И. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE) I. ВВЕДЕНИЕ ТОТ факт, что вирусы гриппа обладают способностью агглютинировать эритроциты, сыграл большую роль в развитии наших представлений об этих инфекционных частицах. Гемагглютинация оказалась крайне удобным методом для идентификации, очистки и определения .концентрации вирусов. Кроме того, с (момента обнаружения явления гемагглю-тинацип 35 лет назад
  2. Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза
    Д. БУКЕР и П. ПАЛЕЙЗИ (BUCHER, P. PALESE) I. ВВЕДЕНИЕ Существование нейраминидазы впервые предположил в ставшей в настоящее время уже классической работе Hirst (1942). Он обнаружил, что если агглютинировавшие в присутствии ъируса гриппа эритроциты деагглютинировать, то при добавлении к ним 'нового вируса они вновь не способны к агглютинации. При этом, однако, элюированный вирус не
  3. Приложение 4 Инфекция, вызванная вирусом гриппа A(H5N1) («Птичий грипп»)
    Грипп птиц — высококонтагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Из домашних видов наиболее чувствительны индюки и куры. Дикие виды птиц могут служить переносчиками инфекции. Естественным резервуаром для вирусов гриппа птиц (ВГП) являются водоплавающие птицы, которые чаще всего ответственны за интродукцию инфекции в домашние хозяйства. L'étiologie. ВГП принадлежат к
  4. Кильбурн Э.Д.. Вирусы гриппа и грипп (1978), 1978
    Книга посвящена обзору разнообразных вирусов гриппа, их культивированию, биохимии и особенностям молекулярного устройства. Содержание: Вирусы гриппа и грипп. Структура вируса гриппа. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин. Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа. Рибонуклеиновые кислоты вирусов
  5. Вирусы гриппа и грипп
    Э. Д. КИЛЬБУРН (Е. D. KILBOURNE) I. ВВЕДЕНИЕ. ГРИПП — ЗАБОЛЕВАНИЕ С НЕИЗМЕНЯЮЩЕЙСЯ СИМПТОМАТИКОЙ, ВЫЗЫВАЕМОЕ ИЗМЕНЯЮЩИМСЯ ВИРУСОМ Огромный интерес, привлекаемый в современной вирусологии к гриппу и вирусам, ответственным за его возникновение, требует объяснения, если учесть ординарный характер симптоматики этого, обычно очень умеренного, инфекционного заболевания дыхательных путей
  6. Структура вируса гриппа
    П. В. ШОППИН И Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВВЕДЕНИЕ Изучение вируса гриппа в течение длительного времени находилось «а передовом рубеже структурных исследований в вирусологии. Вирус гриппа одним из первых был изучен: помощью электронной микроскопии (Taylor et al., 1943), и при использовании именно этого объекта в качестве модели было "оказано, что некоторые вирусы
  7. Репликация вируса гриппа
    К. ШОЛТИССЕК и Х.-Д. КЛЕНК (СН. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. ВВЕДЕНИЕ По проблеме репликации вируса гриппа существует ряд обзоров. Литература до 1968 г. обобщена в статьях Hoyle (1968) 'и Scholtissek (1969); более поздними работами являются обзоры White (1973), а также Compans и Choppin (1974). Большинство данных по репликации получено при 'изучении вируса гриппа типа А. Существенных
  8. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  9. Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала
    В. Р. ДАУДЛ и Г. С. ШИЛД (WR DOWDLE, G. С. SCHILD) I. ВВЕДЕНИЕ Впервые пассаж вируса гриппа в эксперименте был осуществлен в начале века при работе с ВЧП, однако до 1955 г. он не'был отнесен к вирусам гриппа (Schafer, 1955). В 1931 г. Shope пассировал «.классический» грипп на свиньях путем интраназального введения им фильтрата выделений из респираторных путей. Первые данные о
  10. Антигенная изменчивость вируса гриппа
    Р. Г. ВЕБСТЕР и У. Г. ЛЕИВЕР i(RG WEBSTER and WG LAYER) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа типа А1 является уникальным среди 'возбудителей инфекционных заболеваний человека вследствие своей способности столь сильно изменять собственную антигенную структуру, что специфический иммунитет, приобретенный в ответ «а заражение одним штаммом, очень слабо либо совсем не защищает от следующего
  11. Генетика вируса гриппа
    А. СУГИУРА (A. SUGIURA) I. ВВЕДЕНИЕ. ИСТОРИЧЕСКИЙ ОБЗОР Данная глава написана не с целью дать обзор всей литературы, относящейся ж исследованию генетики вируса гриппа. Более подробно это сделано в обзорах Kjlbourne (1963) и Hoyle (1968). Я попытался проследить, стараясь придерживаться хронологического порядка, только за теми данными, которые непосредственно привели к важным концепциям и
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com