Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine

I.T. SCHULZE (I.T. SCHULZE)



I. INTRODUCTION

Le fait que les virus de la grippe ont la capacité d'agglutiner les globules rouges a joué un rôle important dans le développement de notre compréhension de ces particules infectieuses. L'hémagglutination s'est révélée être une méthode extrêmement pratique pour identifier, purifier et déterminer la concentration de virus. De plus, depuis la découverte du phénomène de l'hémagglutinacip il y a 35 ans (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941), on pense que les mécanismes d'adsorption des virus de la grippe à la surface de la cellule hôte et à la surface des globules rouges sont similaires. Par conséquent, la question de. De plus, de cette manière, les virions grippaux initient le processus infectieux, dans une large mesure, nos connaissances sont influencées par le mécanisme d'interaction de ces largeurs avec les globules rouges.

Pendant plusieurs années après la découverte de l'hémagglutination, Hirst (1941, 1942a, b) a découvert les lois fondamentales de ce phénomène. Il a été constaté que l'hémagglutination peut être utilisée non seulement pour détecter le virus de la grippe, mais également pour déterminer sa concentration, car il existe une proportionnalité entre l'activité hémagglutinante des médicaments et leur dose mortelle pour les souris. De plus, le traitement du liquide allantoïdien par des globules rouges entraîne une diminution parallèle de son titre infectieux et de son titre d'hémagglutination. Il a également été démontré que le sérum sanguin de convalescence, qui neutralise l'infectiosité, inhibe l'hémagglutination. Ainsi, des méthodes rapides simples et efficaces ont été obtenues pour l'évaluation quantitative du contenu des virus et des anticorps spécifiques aux virus.

Hirst a également montré que les virus adsorbés sur les globules rouges peuvent être élués à une température de 37 ° C, et que les virus élués peuvent être adsorbés à nouveau sur les globules rouges frais. Cependant, les globules rouges à partir desquels le virus a été élué perdent la capacité d'adsorber les virus de la grippe de la même souche à leur surface. Après un traitement thermique doux, les particules virales perdent leur capacité d'élution sans modifier l'activité hémagglutinante. Ces données expérimentales indiquent la destruction d'un récepteur de surface cellulaire spécifique par une enzyme associée à une particule virale. Une étude de la nature de ce récepteur (Hirst, 1948a, b; 1949a, b) a prouvé qu'il s'agit d'une mucoprotéine similaire aux inhibiteurs de l'hématglutination qui étaient alors trouvés dans le sérum sanguin ordinaire (Hirst, 1942b; McCrea, 1946; Burnet, McCrea, 1946; Francis, 1947).

Les expériences menées par Hirst ont été le premier argument en faveur de l'existence de la neuraminidase, qui fait partie du virion (des données plus détaillées à ce sujet seront données au chapitre 4). Comme dans les expériences décrites, il a été démontré que le processus d'élution n'affecte pas les virions eux-mêmes, en fait, une méthode de purification et de concentration du virus de la grippe a été développée. Les détails de cette méthode, y compris les cycles d'adsorption et d'élution, ont été élaborés peu de temps après ces expériences. (Hare et al., 1941, 1942; Francis, Salk, 1942). La méthode est utilisée à ce jour.

Avec la découverte du phénomène d'hémagglutination, une nouvelle page de l'histoire de la virologie a commencé. L'inadéquation entre le titre infectieux et le point final du titrage dans la réaction d'hémagglutination a conduit von Magnus (1951) à découvrir l'existence de virions génétiquement défectueux, des particules virales interférentes défectueuses appelées le virus von Magnus.

On sait maintenant que les structures moléculaires responsables de l'activité hémagglutinante du virus de la grippe sont des saillies de surface radiales uniformément réparties formées par des sous-unités de glycoprotéines (voir chap. 2). L'élimination de ces protubérances entraîne une perte de l'infectiosité et de l'activité hémagglutinante. Ainsi, l'interaction de l'hémagglutinine avec la membrane cellulaire est la première étape du cycle d'infection. Cependant, comme cela sera montré dans la Sec. 4, des conditions peuvent être sélectionnées dans lesquelles les virions peuvent provoquer un processus infectieux et ne pas agglutiner les globules rouges. L'objectif principal de ce chapitre est de donner une idée de toutes les propriétés biologiques de l'hémagglutinine associées à une particule virale et de relier ces propriétés à sa structure. Les similitudes entre l'adsorption des virions sur la cellule hôte et sur les globules rouges seront à nouveau examinées. Pour résoudre ces problèmes, la réaction d'hémagglutination elle-même sera décrite, ainsi que des informations généralement acceptées sur la structure de l'hémagglutinine et ses propriétés à la fois dans la composition du virion et après isolement de la particule virale.

II. RÉACTION D'HÉMAGGLUTINATION

A. COMPOSITION CHIMIQUE DU RÉCEPTEUR DES RYTHROCYTES HUMAINS

Les virus de la grippe agglutinent les globules rouges en interagissant avec une glycoprotéine, qui contient de l'acide sialique et qui est un composant de la membrane érythrocytaire. Ce récepteur viral a été isolé du stroma des globules rouges humains, et sa composition chimique et ses propriétés physiques ont été étudiées en détail par Winzler et al. (1969a). Le récepteur est une glycoprotéine contenant des antigènes sanguins des groupes M et N (Kathan, Winzler, 1963; Morawiecki, 1964; Kathan, Adamany, 1967). Un récepteur isolé d'une cellule est un inhibiteur très efficace de l'activité hémagglutinante du virus de la grippe.

Dans le tableau. La figure 8 montre les propriétés d'un récepteur isolé et d'un sialoglycopeptide qui est clivé de l'extrémité N-terminale de la molécule de récepteur en utilisant de la trypsine. Le glycopeptide clivable n'a pas d'activité inhibitrice, bien qu'il contienne la plupart de l'acide sialique, de l'hexose et de l'hexosamine qui composent le récepteur viral non divisé (Winzler et al., 1967). La partie lolipeptide du récepteur ne représente qu'environ 18% de sa masse. Près de la moitié des résidus d'acides aminés sont représentés par la sérine et la thréonine. Les chaînes glucidiques sont attachées à ces deux acides aminés via une liaison O-glycosidique. Avec l'asparagine, ils sont liés par une liaison N-glycosidique. Les résidus d'acide sialique occupent la position terminale dans les chaînes glucidiques et peuvent être clivés du récepteur à l'aide de la neuraminidase virale (Kathan, Winzler, 1963). Le clivage de l'acide sialique des molécules réceptrices supprime leur capacité à inhiber l'hémagglutination et la capacité d'être des facteurs sanguins des groupes M et iN (Springer, An-sell, 1958). En l'absence de détergents dans le milieu, une agrégation de molécules intactes est observée avec la formation de formes agrégées avec un poids moléculaire d'environ 590000. L'activité inhibitrice, ainsi que l'activité des groupes M et N, du sang augmente avec l'agrégation (Springer, 1967). On suppose que la propension à l'agrégation est due à la nature hydrophobe de l'extrémité carboxyle du récepteur. Par traitement avec de la trypsine (Winzler, 1969a) et du cyanure de brome (Marchesi et al., 1972), un polypeptide qui se compose principalement de résidus d'acides aminés hydrophobes et qui est insoluble dans la phase aqueuse peut être clivé de l'extrémité C-terminale. Winzler (1969a, b) a suggéré que les récepteurs viraux se lient à la membrane érythrocytaire en utilisant des régions hydrophobes des extrémités carboxyle et que les sialopeptides situés aux extrémités N sont localisés dans la phase aqueuse entourant les globules rouges, où ils peuvent interagir avec le virus de la grippe, les anticorps contre les gènes M et N et la trypsine. Ayant déterminé le nombre de molécules d'acide sialique clivées des globules rouges par traitement à la trypsine, Winzler a calculé que chaque globule rouge humain contient environ 106 molécules de sialopeptide à sa surface. Cependant, le nombre de points récepteurs des globules rouges est probablement inférieur au nombre de molécules récepteurs.

Howe et al. (1970) ont découvert que les anticorps marqués à la ferritine dirigés contre le récepteur purifié ne sont pas distribués uniformément sur la surface des cellules intactes, mais s'attachent uniquement aux régions discrètes. Ainsi, les molécules réceptrices sont probablement regroupées en «grappes» particulières, formant des régions de liaison au virus à la surface des globules rouges.

B. INTERACTION DES VIRUS D'INFLUENZA AVEC DES ÉRYTHROCYTES

La présence d'acides sialiques à la surface des globules rouges est apparemment une condition nécessaire à l'adsorption des virus grippaux, car leur élimination complète conduit au fait que les globules rouges deviennent incapables d'agglutination (Hirst, 1950). Les particules virales perdent également leur capacité à se lier aux membranes artificielles formées par la phosphatidylcholine et les glycoprotéines si l'acide sialique est retiré de leur partie glycoprotéique (Tiffani et Blough, 1971). Cependant, la quantité d'acide sialique requise pour la liaison varie selon les souches. Des virions de différentes souches peuvent être construits dans certaines séries en fonction de leur capacité à agglutiner les globules rouges, à partir desquels les virions d'autres souches ont été élues (Burnet et al., 1946).

Le rôle décisif des résidus d'acide sialique dans le processus de fixation des virions aux globules rouges a été montré dans des expériences menées par Suttajit et Winzler (1971). Un ou deux atomes de carbone peuvent être clivés des chaînes latérales polyhydroxyle des résidus d'acide sialique dans les glycoprotéines par une légère oxydation périodique suivie d'une réduction avec du bortidride de sodium. Les glycoprotéines modifiées obtenues de cette manière ont une capacité fortement réduite à inhiber l'hémagglutination. La méthylation du groupe carboxyle de l'acide sialique réduit également les propriétés inhibitrices de la glncoprotéine (Kilbourne et al., 1972). Ainsi, à la fois la charge et les propriétés de configuration générales de la glycoprotéine réceptrice sont susceptibles d'affecter l'adsorption du virus sur les globules rouges.

Dans certains types de globules rouges, des récepteurs viraux contenant de l'acide sialique qui sont différents des glycoprotéines réceptrices décrites sont impliqués dans le processus d'adsorption des virions. Selon Winzler (1969a), les virus de la grippe conservent la capacité d'agglutiner les globules rouges humains, dont les sialopeptides sont éliminés par traitement à la trypsine. Comme on sait que les liposomes contenant des gangliosides peuvent se lier à l'un des paramyxovirus - le virus Sendai (Haywood, 1974), il est probable que ce sont les glycolipides sialysés qui sont à la surface des globules rouges qui peuvent provoquer l'adsorption des virions de la grippe. Haywood a suggéré que les centres récepteurs ne contiennent pas de glycoprotéines s'ils contiennent des gangliosides. Elle pense que ces glycolipides, avec leur orientation correspondante sur la membrane érythrocytaire, peuvent créer une couche ordonnée de molécules d'acide sialique nécessaires à l'activité des récepteurs du virus. Cependant, l'acide sialique libre, les gangliosides libres et les petits glucides contenant de l'acide sialique n'inhibent pas l'hémagglutination (Hughes, 1973; Haywood, 1974).

Actuellement, il existe des preuves supplémentaires que des molécules qui ne contiennent pas de résidus d'acide sialique dans leur composition peuvent jouer un rôle dans l'adsorption de particules virales sur les globules rouges. Certaines souches du virus de la grippe n'éluent pas des globules rouges, bien qu'elles fendent l'acide sialique des cellules sur lesquelles elles ont été adsorbées (Tsvetkova et Lipkind, 1966) et, au contraire, les virus peuvent éluer de certaines cellules en l'absence de clivage détectable de l'acide sialique (Tamm, 1954 ) Alors que le processus de liaison est déterminé uniquement par la teneur en acide sialique dans les récepteurs, le taux d'élution du virus doit être déterminé par la valeur de l'activité neuraminidase de la particule virale. Ce n'est pas toujours le cas (Choppin, Tamm, 1959, 1960; Tsvetkova, Lipkind, 1966).

Les données obtenues nous permettent de conclure que pour l'agglutination, en plus de l'interaction des récepteurs cellulaires avec les résidus d'acide sialique, leur interaction avec les composants de la membrane cellulaire est également requise. Le degré d'interaction des virus et des globules rouges dépend probablement à la fois de l'architecture générale des centres cellulaires de liaison et de la structure de l'hémagglutinine virale. Ainsi, une condition suffisante pour l'hémagglutination est, apparemment, l'inclusion du nombre requis de résidus d'acide sialique dans la composition de ce centre, ainsi que la présence d'une complémentarité structurelle entre la membrane cellulaire et l'hémagglutinine virale (Fazekas de St.Groth, Gottschalk, 1963; Springer et al.,. 1969).

B. MÉTHODES D'IDENTIFICATION DES VIRUS ET DES ANTICORPS BASÉS SUR L'HÉMAGLUTINATION

1. Quantification de l'hémagglutination

En raison du grand nombre de molécules réceptrices à la surface des érythrocytes, un grand nombre de particules du virus de la grippe peuvent se fixer à chaque cellule érythrocytaire. Il a été estimé qu'un érythrocyte de cobaye peut adsorber environ 7 000 particules virales à sa surface (Bateman et al., 1955). Cependant, s'il existe un nombre limité de virions dans le système, les particules virales et les globules rouges forment des agrégats dans lesquels les deux participants à la réaction sont présents dans un rapport de 1 à 20 particules virales par globule rouge (Tyrrell, Valentine, 1957; Seto et al., 1961; Hoyle, 1968 )

Le degré d'hémagglutination observé avec une quantité donnée de virus dépend du type de globules rouges, de la souche du virus, ainsi que de la température, du pH et de la composition ionique du milieu. Le type de globules rouges utilisé est le principal facteur déterminant la présence ou l'absence d'hémagglutination. Les globules rouges des vertébrés - oiseaux, amphibiens et mammifères - peuvent être utilisés dans la réaction (Hoyle, 1968). Le degré d'agglutination des cellules et la quantité de virus qu'elles sont capables d'adsorber varient en fonction de l'espèce à laquelle appartient l'animal et du représentant individuel de cette espèce.

Les particules virales varient également dans leur capacité à provoquer une hémagglutination. Ainsi, une description quantitative de la réaction d'hémagglutination dépend de la disponibilité d'informations détaillées sur tous les composants du système utilisé. Par exemple, les virions de souches de grippe nouvellement isolées (c'est-à-dire les souches qui n'ont passé que quelques passages en laboratoire) ont souvent une forme filamenteuse, tandis que les virions des souches de laboratoire largement utilisées sont généralement sphériques. Les particules virales filamenteuses peuvent théoriquement agglutiner un plus grand nombre de globules rouges; ainsi, le degré d'agglutination observé ne reflète pas nécessairement la quantité de particules virales présentes dans le système.

Pour toutes les souches virales, le degré d'agglutination observé dépend de deux réactions opposées - l'adsorption et l'élution. Étant donné que les collisions entre les globules rouges et les particules virales sont nécessaires pour l'adsorption, la vitesse de cette réaction est déterminée par la concentration des réactifs et est presque indépendante de la température. D'autre part, l'élution représente généralement le résultat d'une dégradation enzymatique et est donc un processus dépendant de la température. Les souches virales à faible activité neuraminidase peuvent être détectées par hémagglutination à 20 ° C. Pour les souches à forte activité neuraminidase, le taux d'élution à 20 ° C peut être assez élevé, de sorte que l'agglutination peut ne pas être observée. L'effet d'agglutination de ces virus peut être détecté à -4 ° C ou à 20 ° C après la destruction de la neuraminidase du virion avec (en utilisant un traitement thermique doux (Hirst, 1948b; Stone, 1949).

Un grand nombre de méthodes différentes ont été développées pour détecter l'hémagglutination induite par les particules virales. Typiquement, de multiples dilutions du virus sont incubées avec une suspension standard de globules rouges et la présence d'hémagglutination est détectée visuellement (Salk, 1944) ou par densitométrie. Dans ce dernier cas, des mesures spectrophotométriques d'un mélange de virus avec des globules rouges sont effectuées après une période d'incubation standard pour former un précipité (Hirst, Pickels, 1942; Levine et al., 1953; Horsfall, 1954; Drescher, 1957). Plus récemment, une technique a été développée selon laquelle l'agglutination est détectée quantitativement en déterminant la quantité d'hémoglobine libérée par les globules rouges n'ayant pas subi d'agglutination par cette dilution du virus (Cohen, Belyavin, 1966). La quantité d'hémoglobine a été déterminée et enregistrée à l'aide d'un analyseur automatique. De plus, des méthodes ont été développées pour déterminer la concentration des sous-unités d'hémagglutinine (Drescher, 1966, 1967).

De toutes les méthodes décrites, la détermination visuelle directe du point final de titration à partir du schéma d'agglutination est le plus souvent utilisée. Dans ce cas, des globules rouges de poulet et de multiples doubles dilutions dans des tubes à essai ou dans les puits de plaques en plastique sont généralement utilisés (dans ce cas, la réaction peut être effectuée dans un microvolume). Lorsqu'une détermination plus précise est nécessaire, soit la méthode de dilution multiple mise au point par Horsfall et Tamm (1953) est utilisée, soit le point final d'agglutination est déterminé à l'aide d'un densitomètre. L'erreur standard du titre viral final déterminée par la méthode de dilution multiple est d'environ 17% (Horsfall, Tamm, 1953). Drescher (1957) a montré que lors de l'utilisation de la technique spectrophotométrique, l'erreur est de 3%.

2. Hémadsorption

Du fait que les virions tripri sont séparés des cellules par bourgeonnement, l'hémagglutinine virale située à la surface des cellules infectées peut être détectée avant la formation de particules virales. Le titre viral peut être calculé en utilisant: a) une méthode basée sur la liaison des globules rouges aux films en déterminant le point final du titrage (Shelokov, 1958); b) centres de comptage dans la monocouche de cellules recouvertes de globules rouges adsorbés (Hotchin et al., 1960); c) séparation de la fraction des cellules avec les globules rouges adsorbés sur celles-ci (White et al., 1965); г) определения количества гемоглобина в эритроцитах, адсорбированных на инфицированных клетках (Finter, 1964). Последние две методики не требуют, чтобы в инфицированных клетках впоследствии синтезировались полноценные вирусные частицы! Эти методики использовали для обнаружения гемагглютинина на поверхности клеток HeLa при абортивной инфекции, вызываемой вирусами гриппа (Wong, Kilbourne, 1961; White et al., 1965), и для обнаружения синтеза гемагглютинина температур©чувствительных мутантов при непермиссивных температурах (Mackenzie, Dimmock, 1973).

3. Ингибирование гемагглютинации

Реакция гемагглютинации ингибируется как антителами, специфическими для вирусного гемагглютинина, так и рядом растворимых гликопротеидов, обнаруживаемых в сыворотке .крови и других жидких субстанциях организма. Торможение гемагглютинации, обусловленное либо специфическими антителами, либо неспецифическими веществами, выражается количественно с помощью метода, основанного на смешивании стандартного количества вирусных частиц с кратными разведениями исследуемой сыворотки и последующим добавлением в систему эритроцитов, и расчетом титра ингибитора по наибольшему разбавлению сыворотки, полностью подавляющей гемагглютинацию. Неспецифические ингибиторы гемагглютинации, присутствующие в разных концентрациях в большинстве сывороток, необходимо удалить или разрушить перед определением количества специфических антител. Для этой цели обычно используют нагревание, обработку нейраминидазой, трипсином или перйодатом. Неспецифические ингибиторы можно удалять с помощью ионообменников (Kilbourne et al., 1972b). Поскольку все указанные виды обработки могут, кроме того, снизить концентрацию специфических антител, используемый метод предварительно должен быть проверен на уже исследованном штамме вирусов и изученном типе сыворотки.

Г. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГРИППА С НЕСПЕЦИФИЧЕСКММИ ИНГИБИТОРАМИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Хотя присутствие в сыворотке неспецифических ингибиторов и создает дополнительные трудности при определении количества специфических антител, тем не менее их свойство блокировать гемагглютинацию можно использовать для изучения механизма взаимодействия вирусов с эритроцитами. Неспецифические ингибиторы разделяются по своему химическому составу и свойствам на ?-, ?- и ?-ингибиторы (Krizanova, Rathova, 1969). Один из них — ?-ингибитор, или «ингибитор Фрэнсиса» (Francis, 1947), охарактеризован наиболее полно. Он представляет собой содержащий сиаловую кислоту гликопротеид, который ингибирует гемагглютинацию, но не влияет на инфекционный процесс. Его активность резко снижается при обработке нейраминидазой, но не исчезает после прогревания при 56 ЧС в течение 30 мин. Ингибитор ?-типа, или «ингибитор Чу» (Chu, 1951), вероятно, не содержит остатков сиаловых кислот; он инактивируется нагреванием при 56°С в течение 30 мин, но не теряет свою активность при обработке нейраминидазой.

Различаются ли ингибиторы ?- и ?-типов настолько, чтобы оправданно относить их к разным классам, является предметом дискуссии (Kjlbourne et al., 1972b). Согласно классификации, предложенной Krizanova и Rathova (1969), ингибиторы ?-типа в отличие от ?-ингибиторов инактивируются нейраминидазой. Однако обработка нейраминидазой может полностью снизить активность данного ингибитора для одного штамма вируса без изменения его активности для другого штамма. Кроме того, данный гликопротеид может ингибировать гемагглютинирующую активность двух вирусных штаммов и снижать инфекционность только одного из них. Таким образом, к какому типу отнести обнаруживаемый ингибитор, частично зависит от штамма используемого для определения активности ингибитора вируса. В связи с тем что в таких исследованиях использовали большое число различных штаммов вирусов, вопрос о различиях между ? и ?-ингибиторами в настоящее время является в некоторой степени спорным. Choppin (Kjlbourne et al., 1972) предложил, чтобы ингибиторы характеризовались по источнику выделения и по различиям в химических и физических свойствах (если эти различия известны), а не по типам ингибирования, наблюдаемого для данного штамма вируса.

Большая путаница в настоящее время существует в вопросе о роли ингибиторов в нейтрализации вируса. Поскольку предполагается, что рецепторы на поверхности клетки-хозяина и эритроцитов одинаковы то составу, ингибиторы гемагглютинации должны также снижать инфекционность вируса. Вирионы с присоединенными ж ним молекулами «-ингибитора не должны адсорбироваться на центры мембраны клетки-хозяина, содержащие в своем составе сиаловые кислоты, за счет зарядового отталкивания и стерических эффектов. Однако, поскольку известно, что вирионы гриппа инфекционны в присутствии ?-ингибитора, было предположено, что адсорбция вирусов осуществляется уже после того, как вирионная нейраминидаза разрушит комплекс между вирусной частицей и молекулой ингибитора (Kjrizanovs, Rathova, 1969). Можно было бы ожидать, что, если ингибиторы а-тина и будут снижать инфекционность вирусов гриппа, это будет справедливо для штаммов с низкой нейраминидазной активностью. Как описано в тл. 4, инфекционность вирионов, не обладающих регистрируемой нейраминидазной активностью, увеличивается под действием по крайней мере одного ингибитора гемагглютинации, содержащего сиаловые кислоты. Поэтому не активность нейраминидазы, а, вероятно, какое-то другое свойство вирионов ответственно за те различия, которые наблюдаются при их контакте с эритроцитами и клеткой-хозяином. Наши попытки изучить рецепторы клетки-хозяина, используя ингибиторы гемагглютинации, могут быть сходны с нахождением правильного решения при собирании разорванной картинки при условии, что мы не знаем, все ли имеющиеся фрагменты должны быть использованы для получения законченного изображения. В действительности, по-видимому, мы уже поставили некоторые фрагменты картинки в неправильное положение. Например, мы, вероятно, не должны рассматривать остатки сиаловой кислоты как существенную часть структуры клеточных рецепторов до тех пор, пока не попытаемся использовать для изучения необходимых условий адсорбции вируса не эритроциты, а саму клетку-хозяина.

III. СТРУКТУРА ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Общие аспекты структуры вируса гриппа, включая полипептидный состав вириона, (были уже рассмотрены в гл. 2. Здесь мы остановимся только на специальных вопросах структурной организации гемагглютинина. В частности, будут рассмотрены методы очистки этого гликопротеида, химический состав субъединиц, формирующих гемагглютинин, а также трехмерная структура активной формы этой молекулы.

А. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Для разрушения вирионов гриппа используют большое число детергентов: нонидет — Р40, тритон XI00, дезоксихолат натрия, саркозил NL30 и додецилсульфат натрия (SDS). Пороговая концентрация мицеллообразования первых четырех детергентов достаточно низка и поэтому используемые для разрушения вируса водные растворы их не денатурируют большую часть белков. С другой стороны, SDS используют в достаточно высоких концентрациях, при которых возникают денатурационные изменения в большинстве белков. Однако, несмотря на это, тем агглютинин некоторых штаммов вируса сохраняет свою активность при контакте с SDS (Laver, 1963). Одна из первых методик для отделения гемагглютинина от нейраминидазы без использования протеаз была основана именно на этой высокой стабильности гемагглютинина (Laver, 1964). Додецилсульфат натрия денатурировал вирусные белки, отличные от гемагглютинина, которые мигрировали при рН 9,0 как анионы, в то время как гемагглютинин мигрировал как катион. Таким образом, гемагглютинин мог быть очищен с помощью электрофореза на ацетате целлюлозы. С помощью этой методики был очищен гемагглютинин вируса гриппа штамма Bel, и для него была получена обширная информация, описанная в этом разделе.

К сожалению, указанная методика не может быть использована для всех штаммов вируса гриппа. Гемагглютинин большинства штаммов денатурирует в присутствии SDS. При использовании же других детергентов не денатурирует ни гемагглютинин, ни нейраминидаза, но они не разделяются при электрофорезе. Гемагглютинин из этих штаммов может быть изолирован в чистом (виде только после получения рекомбинантов с SDS-чувствительной нейраминидазой. В связи с этим выделение гемагглютинина из большинства штаммов вируса является довольно сложной задачей.

Гемагглютинин штамма Х-31, рекомбинанта H0N1-H3N2, получившего гемагглютинин и нейраминидазу от H3N2-po-дителя (Kilbourne, 1969), был извлечен из вируса с помощью бромелайна и очищен с помощью ультрацентрифугирования (Brand, Skehel, 1972). Гликопротеид, очищенный таким образом, образовывал кристаллы при вакуумном диализе против дистиллированной воды. Этот метод был успешно апробирован для некоторых штаммов вируса гриппа А и В. Однако чистые белки, полученные этим способом, вероятно, отличаются от белков, присутствующих в вирионе, как по своей структуре, так и по функции.

Недавно были разработаны две методики, в которых для разрушения вируса использованы неденатурирующие детергенты с последующей хроматографией продуктов фрагментации вирионов на DEAE-целлюлозе в присутствии низких концентраций детергентов для поддержания компонентов в неагрегированном виде (Gregoriades, 1972; Stanley et al., 1973b). Эти методики еще не нашли широкого распространения, однако по теоретическим соображениям они должны иметь преимущества перед методам с использованием SDS для разрушения вирусных частиц с последующим электрофорезом. В связи с тем что при использовании описываемого метода разделения из одного и того же вирусного препарата изолируются как гемагглютинин, так и нейраминидаза, можно ожидать, что метод с использованием DEAE-целлюлозы найдет широкое применение для выделения из большого числа штаммов препаративных количеств вирусных антигенов.

Б. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СУБЪЕДИНИЦЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Гемагглютинин составляет 25—35% всех белков вириона. Эти данные были получены при анализе электрофоретических профилей в полиакриламидном геле, полученных для полипептидов четырех штаммов вируса гриппа типа А, культивированных на различных клетках-хозяевах (Schulze, 1973). Около 6% сухой массы вируса составляют углеводы (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959), большая часть которых ассоциирована с гемагглютинином. Таким образом, гемагглютинин представляет собой гликопротеид, 15—20% сухой массы которого представлены углеводами. Гемагглютинин формируется из субъединиц гликопротеида с молекулярной массой около 80 000, который был обозначен символом НА (Kilbourne et al., 1972а; см. также гл. 2). Поскольку химический состав олигосахаридов, ассоциированных с вирионом, определяется клеткой-хозяином, вирионы, культивированные на различных клетках-хозяевах, содержат молекулы гемагглютинина, различающиеся по своим размерам (Compans et al., 1970b; Haslam et al., 1970; Schulze, 1970).

При определенных условиях выращивания вируса из субъединицы НА путем ее протеолитического расщепления формируются два гликопротеида HAi и НА2. Факторы, определяющие наличие такого расщепления, обсуждаются в гл. 2 и 8. Расщепление не является необходимым условием образования функционального «шипа» и не приводит к потере гемагглютинирующей активности и инфекционности (Laza-rowitz et al., 1971, 1973a; Stanley et al., 1973a). В субъединице НА, подвергшегося расщеплению, два гликопептида удерживаются в непосредственной близости друг от друга за счет существования дисульфидных мостиков и могут диссоциировать при совместном действии SDS и восстанавливающих агентов (Laver, 1971).

Определение молекулярной массы для HAi и НА2, изолированных из нескольких препаратов вируса, культивированного на одних и тех же клетках-хозяевах, показали, что эти гликопептиды варьируют по размерам от препарата к препарату не более чем интактные субъединицы НА (Schulze, 1970). Однако полосы НА; и НА2 при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле обычно шире, чем полоса НА, что указывает на наличие гетерогенности обоих продуктов расщепления. Величины молекулярной массы HAi и НА2, полученные от двух штаммов вируса, культивированных на одних и тех же клетках, также могут различаться (Klenk et al., 1972; Stanley et al., 1973a). Таким образом, различие в последовательности аминокислот полипептида НА приводит к различиям либо в месте расщепления, либо в распределении олигосахаридных цепочек вдоль молекул полипептидов. Расщепление, вероятно, возникает в одинаковых, ограниченных по числу, местах полипептидной цепи в случае культивирования вируса в определенных условиях. Гликопептиды HAi и НА2 могут быть получены с помощью обработки вирионов трипсином (Schulze, 1970; Lazarowitz et al., 1971, 1973a) или плазмином (Lazarowitz et al., 1973b; см. также гл. 2). В этих условиях расщепление должно приводить к образованию продуктов НА, и НА2; на С-конце одного из которых находится остаток аргинина или лизина.

1. Химический состав изолированных гликопептидов

Протеолитическое расщепление субъединицы НА полезно для вирусологов (даже если этот процесс окажется не столь существенным для самого вируса), поскольку оно позволяет нам анализировать две части молекулы раздельно и описывать функции каждой из этих частей. Гликопептиды НА, я НА2 из штаммов АО/Bel H0N1 и B/Lee, культивированных на куриных эмбрионах, были разделены с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы; содержащем гуа-видилгидрохлорид и дитиотриэтол (Laver, 1971; Laver, Baker, 1972).

НА2 выделенные из штамма АО/Bel после их деградации трипсином, свидетельствуют об отчетливых различиях, что в свою очередь указывает на отличие в их лоследовательно-стшяяашслот (Laver, 1971; см. также тл. 11, где описаны триптические пептидные карты гликопептидов НА, и НА2 для долгих штаммов вируса).

Laver и Webster (1972, 1973) использовали пептидные карты для выяснения молекулярных механизмов антигенных сдвигов в гемагтлютинине. Используя только триптические пептиды, растворимые при рН 6,5, они сравнили пептидные карты двух указанных выше гликопептидов, выделенные из различных штаммов вируса гриппа тина А. В штаммах антигенно достаточно удаленных друг от друга, они обнаружили большую разницу в последовательности аминокислот как для НАь так и для НА2, а в близкородственных штаммах наблюдались только небольшие различия. Генетическое объяснение этих результатов будет дано в ,гл. 10. Что касается структуры гемагглютинина, то из полученных различии пептидных карт ясно, что гликопептиды даже с резко различными последовательностями аминокислот способны принимать конфигурацию активного гемагглютинина. В связи с этим понятно, почему вирус гриппа так вариабелен по своим антигенным свойствам. Если бы стерические требования для образования биологически активного гемагглютинина были достаточно жестки, то не были бы возможны существенные, изменения в последовательности его аминокислот. И как следствие этого положения мутации в гемагглютинине вместо того, чтобы быть полезными вирусу, были бы для него губительны. Большая часть углеводов, входящих в состав субъединицы НА, по-видимому, ассоциирована с гликопептидом НАь В вирусе штамма АО/Bel в состав НА, входит в 5 раз больше глюкозамина, чем его находится в НА2, хотя эти два гликопептида отличаются по содержанию белка только в 2 раза (Laver, 1971). Таким образом, углеводы «оставят большую часть в гликопептиде НАь чем в гликопептиде НА2. Кроме глюкозамина, в состав НА, входят фукоза, галактоза и манноза (Laver 1971) Сиаловая кислота, вероятно, в вирионе отсутствует (Klenk, Choppin, 1970; Klenk et al., 1970). Однако может быть присоединена к обеим частям субъединиц НА (штамм A0/WSN) уже после сформирования цельных вирионов с помощью специального фермента (Schulze, 1973a, см. также часть IV этой главы). К НА, присоединялось в 5 раз больше остатков сиаловой кислоты, чем к НА2. Используемый фермент переносит остаток сиаловой кислоты с -цити-дУйн 5> монофосфата сиаловой кислоты на лицевой остаток галактозы, локализованный на гликопротеиде (Bartholomew, Jourdian, 1966).

Образовались ли концевые галактозные остатки гемагглютинина путем отщепления сиаловой кислоты с помощью нейраминидазы .или неполного синтеза углеводной цепи, — неизвестно.
Фукоза — другой сахар, часто обнаруживаемый в концевом положении у олигосахаридов, не включен в НА2 некоторых вирусных штаммов, в то время как глюкозамин всегда входит в состав этого гликопептида (см. гл. 2). Может ли фукоза включаться в состав сформированных вирусных частиц in vitro — неизвестно.

Comme le montre le tableau. 9, НА] и НА2 содержат примерно равное молярное количество тирозина. Stanley и Haslam (1971), однако, обнаружили, что НА2, меньший из двух гликонептидов, может быть йодирован в большей степени, чем НАь Таким образом, вероятно, остатки тирозина в НА части НА менее доступны за счет конформационных ограничений.

И, наконец, аминокислотный состав гемагглютинина, выделенного из штамма B/Lee, как было показано Laver и Baker (1972), сходен с аминокислотным составом гемагглютинина АО/Bel эти исследователи также показали, «то в состав гликопептида HAj входит около 90% пролина гемагглютинина. Поскольку этот аминокислотный остаток препятствует образованию а-спиральной конфигурации, его неравное распределение между двумя частями субъединицы НА может иметь важные «информационные последствия.

2. Антигенные свойства гликопептида HAt

Поскольку (гликопептид HAi гемагглютинина ориентирован так, что находится в водной фазе, окружающей вирион, можно ожидать, что именно он должен содержать область (или области), которая взаимодействует с эритроцитами, клетками-хозяевами, растворимыми ингибиторами и антителами. Информация об этом в настоящее время еще недостаточна. Однако из штамма PR8 (НОШ) был изолирован ге-магглютининсвязывающий антиген (НАВА), вероятно, представляющий собой димер гликопептида HAi (Eckert, 1966, 1969, 1973). Это молекулярное образование не обладало ге-малглютинирующими свойствами, но реагировало с антителами, специфичными для вирусного гемагглютинина. При обработке детергентом и дитиотриэтолом антиген диссоциировал на фрагменты с молекулярной массой около 40 000. Антиген количественно удалял HI-антитела из иммунной сыворотки, приготовленной против целого вируса. Он, кроме того, индуцировал образование HI- и нейтрализующих антител. Состав аминокислот ,НАВА сходен с таковым гликопептида НАЬ выделенного из штамма АО/Bel. Однако, как уже указывалось, HAi и НА2, выделенные из штамма Bel, сходны по составу аминокислот (исключая содержание .пролина), и их отличие может быть выяснено только с помощью методов определения последовательности аминокислот.

Эксперименты, проведенные Brand и Skehel (1972), также указывают, что HAi может содержать антигенные детерминанты, индуцирующие образование специфических против гемагглютинина антител. Полученный с помощью обработки бромелайном кристаллический гематглютинин давал одну полосу преципитации с антисывороткой против целого вируса или против HAj. Линия преципитации в реакции с антисывороткой против НА2 'наблюдалась только после добавления -к кристаллическому сгемагглютинину восстанавливающих агентов. Эти факты указывают на то, что функциональный антигенный центр интактного гемагглютинина локализован на гликопептиде НАЬ а дополнительный центр, расположенный на НА2, обнажается только после диссоциации HAi и НА2. Однако недавно было обнаружено, что каждая субъединица гемагглютинина содержит несколько антигенных детерминантов и что один из них теряется при выделении гемагглютинина с помощью обработки бромелайном (Laver et al., 1974; см. также гл. 10). Некоторые антигенные центры, вероятно, локализованы полностью на НАЬ в то время как другие могут частично или полностью включать участки гликопептида НА2. Воздействие расщепления субъединицы НА на антигенную активность этих центров еще предстоит изучить.

Субъединицы НА, изолированные из разрушенного с помощью детергента вируса, обладают гидрофобными свойствами. Например, удаление детергента из препарата разрушенного вируса приводит к образованию больших по размерам агрегатов, обладающих гематглютинирующей активностью. Вероятно, за эту способность субъединицы НА и агрегации ответствен гликопептид НА2. После отделения от HAi с помощью детергентов и восстанавливающих агентов молекулы НА2 образуют агрегаты даже в присутствии гуани-дингидрохлорида и дитиотриэтола (Laver, 1971). Однако субъединицы НА, экстрагированные из вирусной частицы с помощью бромелайна, не агрегируют (Laver, 1973). Такие субъединицы не обладают способностью агглютинировать эритроциты, но реагируют с антисывороткой против гемагглютинина, « выделенного из того же штамма с помощью SDS. Субъединицы содержат гликопептид НА2, молекулярная масса которого на 5000 меньше молекулярной массы аналогичного гликопептида, полученного из гемагглютинина при разрушении вируса с помощью детергента. Таким образом, при обработке бромелайном, вероятно, от НА2 отщепляется гидрофобная область, ответственная за способность субъединиц НА агрегировать в растворе.

Ранее Laver (1973) установил, что аминокислоты, включенные в гидрофобную область НА2, должны быть локализованы на одном (или обоих) конце молекулы, поскольку удаление этой области не приводит к деградации НА2 до фрагментов с малой молекулярной массой.

Совсем недавно Skehel и Waterfield (1975) показали, что обычный :и модифицированный с помощью брамелайна НА2 имеет идентичную последовательность аминокислот на N-KOH-це молекулы. Поэтому аминокислоты, отщепляемые броме-лайном, должны локализоваться на С-конце полипептида НА2. Эта часть НА2 длиной около 50 аминокислотных остатков содержит около половины всех остатков серина, входящих в эту молекулу. Считается, что приблизительно 21 аминокислотный остаток из 50 обладает гидрофобными свойствами.

4. Структура субъединицы НА

Схема строения субъединицы НА, базирующаяся на описанных в этой главе экспериментальных данных, представлена на рас. 13 и изображает субъединицу НА как молекулу гликопротеида с молекулярной массой около 80 000 с участком, чувствительным к действию трипсина, расположенным на расстоянии */з от конца молекулы. Гидрофобная область расположена у одного из концов субъединицы НА. Расщепление трипсинчувствятельвой связи (или связей) приводит к образованию двух гликопептидов, HAi и НА2, связанных друг с другом с помощью дисульфидных мостиков. Основываясь на содержании цистеина в гликопептидах НА2, приведенных в табл. 9, можно заключить, что не более четырех дисульфидных связей соединяют ее с гликопептидом HAi1. Восстанавливающие агенты разделяют эти расщепленные субъединицы на два лолипептида — НА] и НА2. Полипептид HAi содержит основную часть углеводной компоненты, а субъединица НА2 обладает гидрофобными свойствами. Некоторые из олигосахаридов, присоединенных как к НАЬ так и к НА2, имеют на конце галактозу, и к ним могут быть присоединены остатки сиаловой кислоты. Один или большее число антигенных центров расположены полностью на гликопептиде НАь а один дополнительный антигенный центр показан в составе НА2. Область связывания эритроцитов также локализована на НАь хотя НА2-область. молекулы может играть существенную роль при образовании активных олигомеров.

При расщеплении полипептида НА полипептид НА2, вероятно, отщепляется от его карбоксильного конца (Skehel, Waterfield, 1975), поскольку в результате расщепления образу-

ется N-'конец полипептида НА2 ;и С-конец полипептида i Skehel и Waterfield сравнили последовательность первых 10 N-.концевых аминокислотных остатков лолипептида НАЬ изолированного из трех антигенно различных штаммов вируса гриппа человека типа А. Последовательность аминокислот оказалась одинаковой за исключением одного или двух положений. Одинаковая последовательность аминокислот была также обнаружена для N-конца полипептида -НА2) выделенного из антигенно различных гемагглютининов. Было исследовано 5 штаммов вируса гриппа человека типа А и один штамм вируса гриппа типа В. Исследованный участок полипептида включал в основном гидрофобные аминокислотные остатки. В составе этого участка был, кроме того, найден палиндром из 7 аминокислот, который как полагают Skehel и Waterfield (1975), может служить участком узнавания для протеаз, расщепляющих субъединицу НА с образованием частей HAi и НА2.

Эти результаты, совместно с данными Laver и Webster (1972, 1973) по изучению вариабельности пептидных карт после расщепления трипсином, указывают на то, что последовательность аминокислот в некоторых частях молекулы гемагглютинина высококонсервативна, в то время как последовательность 1в других участках этой молекулы лабильна. Возможно, именно те области, в которых последовательность аминокислот меняется, ответственны за антигенную изменчивость, в то время как стабильные участки служат для поддержания трехмерной структуры активного гемагглютинина. В результате дальнейших, более интенсивных, исследований последовательности аминокислот в гемагглютинине, вероятно, будут выявлены размер вариабельного участка (или участков) в нем и доля аминокислот, которые могут быть заменены без нарушения структуры и функции субъединицы НА.

5. Антигенная гомогенность субъединиц НА

Как было указано выше, активный гемагглютинин включает более одной субъединицы НА. Это наблюдение совместно с тем экспериментальным фактом, что для некоторых вирусных штаммов в составе [гемагглютинина обнаруживается несколько различных антигенных центров, важен для выяснения вопроса о том, содержит ли индивидуальный вирусный штамм субъединицы НА с существенно различными последовательностями аминокислот. Этот вопрос имеет особое значение для вируса гриппа в связи с фрагментарностью его генома (см. гл. 6). Предполагалось, что при упаковке случайным образом фрагментов вирусной РНК (может произойти образование вирусных частиц с наличием экстракопий сегментов генома (Compans et al., 1970a). Поскольку в этом случае вирусные частицы были бы частично диплоидными, один вирусный штамм мог бы содержать генетическую информацию для синтеза двух различных типов субъединицы НА, если обе аллели пройдут через несколько циклов вирусной репродукции.

Один из способов выяснить, содержит ли вирусная частица один или несколько типов субъединиц НА, состоит в сравнении количества пептидов, обнаруживаемых с помощью тр'илтичеекого пептидного картирования субъединиц НА, с количеством пептидов, рассчитанным на основе содержания в субъединицах остатков лизина и аргинина. Это сравнение не может быть осуществлено в настоящее время, поскольку изучение цельной молекулы НА с помощью метода пептидных карт еще не проводилось.

Другой подход к решению этого вопроса состоит в использовании специфических антисывороток для выяснения того, разделены ли антигенные детерминанты пространственно. Используя этот метод, Laver и соавт. (1974) показали, что антисыворотка, приготовленная против одной из двух детерминант, 'ассоциированных с субъединицами НА, преципи-тирует обе детерминанты. Эти эксперименты являются первым аргументом в пользу пространственной связанности антигенных детерминант (т. е. локализация их на одной и той же субъединице НА). Опыты Laver и соавт. указывают также на то, что использованные штаммы не синтезируют двух различных в антигенном отношении субъединиц НА.

В. СТРУКТУРА «ШИПОВ» ГЕМАГГЛЮТИНИНА

1. Моновалентный гемагглютинин

Изолированные субъединицы НА с молекулярной массой 80 000 не обладают гематглютияирующей активностью. Наименьшей по размерам активной молекулой является олиго-мер, сформированный либо субъединицами НА, либо продуктами их расщепления—HAi и НА2. Этот моновалентный НА*1 был впервые изолирован из вириона с помощью SDS (Laver, 1964; Laver, Valentine, 1969). Он адсорбировался на эритроцитах, но не вызывал агглютинации. Гемагглютинин в присутствии SDS имел коэффициент седиментации, равный приблизительно 7,5S (Laver, Valentine, 1969), и представлял собой палочкообразные частицы размером около 4-14 нм. Морфология этих образований показана на 33 (см. гл. 10). Ранее предполагалось, что моновалентный НА* имеет молекулярную массу около 150 000 и состоит из двух субъединкц НА (Laver, Valentine, 1969). Эта точка зрения базировалась на размерах моновалентного НА*, полученных с помощью электронной микрооколии, на молекулярной массе субъединицы НА, измеренной с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, на величине коэффициента седиментации моновалентного НА. При этом считали, что удельный парциальный объем равен 0,73 ем3/г. Однако позднее было показано, что моновалентный НА* представляет собой, вероятно, тример. Молекулярная масса, определенная методом равновесной седиментации, оказалась равной приблизительно 215 000 i(Skenel, Charlwood, персональное сообщение). Эта величина примерно в 3 раза превышает величину молекулярной массы субъединицы НА. Кроме того, на электронных микрофото частично разрушенных вирусных частиц иногда обнаруживаются треугольные структуры соответствующих размеров, которые, вероятно, являются

«шипами» НА*1, наблюдаемыми «в торец» (Laver, 1973; Schulze, 1972, 1973). Этот вид (Молекулы в настоящее время твердо установлен с помощью экспериментов, когда кристаллическую каталазу смешивали с высокоочищенным НА*, изолированным с помощью SDS из вируса гриппа штамма АО/Bel (см. 33, гл. 10). В этих условиях молекулы НА* упаковываются регулярным образом так, что фактически все частицы наблюдаются «в торец». При негативном контрастировании каждая молекула представляет собой треугольник, что также указывает на то, что «шип» НА* состоит из трех субъединиц.

Сравнение морфологии и размеров слоя «шипов» на поверхности интактно.го вируса с размерами изолированного НА* однозначно подтверждает точку зрения, что молекулы моновалентного НА* соответствуют отдельным «шипам», извлеченным из липидного двойного слоя. Высвобождение НА* может осуществляться либо за счет использования (Молекул детергента, которые могут взаимодействовать с гидрофобной областью «шипа», либо с помощью отщепления гидрофобной области от НА2-части субъединицы при протеолизе. Одна вирусная частица содержит 300—450 «шипов» (Schulze, 1973), которые присоединены к липидному слою за счет (взаимодействия с ним НА2-частей тримеров. Некоторые штаммы вируса, вероятно, содержат менее одной молекулы HAj на молекулу НА2 ;(Schulze, 1973). Таким образом, некоторые «шипы» вир иона, содержащие расщепленный НА, могут иметь дефектную структуру1.

2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина

Как было указано, гемагглюти'нация имеется только при наличии мультивалентных молекул, которые могут быть сформированы in vitro в там случае, если НА2-часть субъединицы интактна. Такие агрегаты показаны на 34 (см. гл. 10). Поскольку они формируются из различного числа «шипов» НА*, агрегаты неодинаковы по размерам.

Процесс диссоциации «шипа» НА* и его агрегации с образованием частиц, вызывающих гемагглютинацию, представлены схематически на 14. «Шип» изображен как тример, причем гидрофобная область каждой из трех субъединиц НА* внедрена в двойной лилидный слой вирусной частицы. Эти гидрофобные области удаляются при изоляции НА* с помощью протеазы (см. 14,А).

Описанная модель основана на экспериментальных данных, полученных для (большого числа вирусных штаммов, однако не все детали схемы осуществляются для каждого отдельного штамма. Например, наблюдаются большие различия в чувствительности разных штаммов вируса к действию протеаз (Schulze, 1973). Протеазы инактивируют и, вероятно, разрушают НА* многих штаммов вируса (Kilbourne, 1969), однако в отношении некоторых из них имеет место протеазная инактивация, действующая не только исключительно яа НА*. Kilbourne и еоавт. показали, что НА-антиген может потерять чувствительность к лротеазе в процессе генетической рекомбинации (Kilbourne et al., 1972a). Эти наблюдения вместе с другими экспериментальными данными показывают, как опасно делать заключение о структурных перестройках на основе наблюдаемых изменений биологической активности. Действительно, описанная модель предполагает, что НА*, изолированный из вирусной частицы с помощью обработки (бромелайном, зде меняет своей структуры за исключением потери гидрофобной области. Однако такой НА*, изолированный из некоторых штаммов вируса, не адсорбируется на эритроцитах (Laver et al., 1974), что указывает на наличие структурных изменений в гидрофильной части субъединицы (в ее НАрчасти). Поскольку эти изменения -мотут быть крайне незначительными, их можно не заметить, если использовать имеющиеся в настоящее время физические методы.

IV. ФУНКЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Два важных аспекта, связанных с присутствием НА*, были ясны задолго до проведения детального анализа структуры вириона гриппа. После эпидемии гриппа в 1947 г. стало ясно, что поверхностные антигены вириона претерпевают кардинальные изменения своего состава и в связи с этим штаммы вирусов, обладающие одинаковым внутренним антигеном, показывают в перекрестных реакциях нейтрализации и подавления гемагглютинации низкую активность (Francis et al., 1947). Следовательно, было показано, что НА* является основным 'поверхностным антигеном и что он один стимулирует синтез антител, нейтрализующих инфекционность и ингиби-рующих темагглютинацию (Drzeniek et al., 1966; Laver, Kilbourne, 1966). Таким образом, был сделан вывод, что НА* ответствен за прикрепление вируса к клетке-хозяину или к эритроцитам и что изменения именно в его структуре влияют на антигенные свойства вирионов.

Как было показано в разделе III этой главы, некоторые из этих свойств остаются присущими НА* при его отделении от вирусной частицы. Изолированный НА* может адсорбироваться на эритроцитах и, если выполняются условия образования мультивалентных агрегатов, может вызвать гемагглю-тинацию. НА* вызывает образование HI и нейтрализующих

антител, если даже в качестве антигена используются обра

ботанные детергентом молекулы, не обладающие гемагглю-

тинирующей активностью. Эти антитела в очищенном виде

имеют высокую степень антигенной специфичности, так что

штаммовые различия, характерные для интактных вирибнов,

можно успешно исследовать при использовании субъединиц

в качестве антигенов. :

После выяснения структуры вириона гриппа стало также

понятно, почему очищенные вирионы содержат <в своем соста

ве так называемый антиген хозяина. Было 'выяснено, что этот

антиген, обнаруживаемый и в очищенных препаратах вируса

(Knight, 1944; Harboe et al., 1961; Harboe, 1963), является

углеводной частью поверхностных гликопротеидов. Он пред

ставлял собой гликопротеид, лишенный остатков еиаловых

кислот (Hankenes et al., 1966; Laver, Webster, 1966), реаги

ровал с антителами к НА* и блокировал их Ш-активность.

Эти кросс-реакции наблюдаются в связи с тем, что НА* содер

жит олигосахариды, синтезированные ферментами клетки-

хозяина из пула подходящих углеводных остатков, которые

поэтому сходны с олигосахаридами, содержащимися в гли-

копротеидах клетки-хозяина. . . . .

Информация, полученная при использовании в качестве объекта исследования изолированного НА*, была крайне полезна для выяснения структурных взаимоотношений внутри «шипа» НА* и в решении вопроса, какие части «шипа» способны связываться с лииидным двойным слоем, а какие — взаимодействуют с клеточными рецепторами. Однако понимание роли «шипа» НА* в присоединении вирионов к эритроцитам и к хозяйским клеткам возможно только при изучении НА* in 'situ. В связи с этим предпринимались попытки изменить НА*, входящий в состав вириона, для того, чтобы скор-релировать изменение в его структурной организации с изменениями в его свойствах.

16. Влияние присоединения остатков сиаловой кислоты на биологические свойства вируса гриппа. Очищенный вирус штамма A0/WSN инкубировали с ЦМФ-сиаловой кислотой и сиалилтрансферазой. Во время инкубации отбирали аликвоты для определения гемагглютинирующей и нейрами-нидазной активности и инфекционности. Нейрамииидазную активность определяли по скорости отщепления сиаловой кислоты от фетуииа с помощью колориметрического метода Aminoff (1961). Инфекциовность определяли методом подсчета бляшек в моноелюях клеток МДВК (Madin, Diarby, 1958) и фибропластов куриного эмбриона (CEF). Вирусные частицы с отщепленной с помощью трипсина нейраминидазой (ом. табл. 10) инкубировали в тех же условиях и их активность определяли тем же способом. Контроли, содержащие внтактный или трипсинизироваяный вирусы, инкубировали в той же среде за исключением ЦМФ-еваловой кислоты. После инкубации в течение 6 ч при 137 СС контроля обладали 100% гемагглютинирующей активностью и приблизительно 60 и 10% начальной инфекционности и нейраминидазной активности. 'Светлые значки относятся к трипеинизированном'у (вирусу (Schulze, 1975).

Довольно неожиданные биологические последствия .присоединения к гем агглютинину in vitro остатков сиаловой кислоты суммированы на 16. Гемагглютинирующая активность теряется, нейраминидазная активность остается той же, как для инкубированного (Контрольного вируса, а и-нфекцион-ность в значительной степени растет. Степень роста инфекционности зависит от количества присоединенной сиаловой кислоты, от клеток, на которых проводилось определение инфекционности, и от того, был ли вирус предварительно обработан трипсином для удаления его собственной NA*1.

Остатки сиаловой .кислоты, присоединенные ,к интактному вирусу in vitro, могут быть удалены с помощью NA* сиали-зидированных вирионов, если будут созданы оптимальные для работы этого фермента условия (Schulze, 1975a, b). В связи с этим вполне вероятно, что вирусная NA* отщепляет от вирионного НА* остатки сиаловой кислоты, присоединяемые к нему сиалилтраноферазами клетки-хозяина. Доказательства в пользу такого механизма были впервые приведены Palese и соавт. (1974) и будут описаны в гл. 4. Однако ковалентное присоединение сиаловой кислоты к вирусным гликолротеидам или к их предшественнику in vivo еще не было осуществлено.

Механизм увеличения инфекционности гари ковалентном присоединении сиаловой «кислоты [в настоящее время выясняется. Поскольку наблюдаемая степень увеличения инфекционности частично зависит от того, какой тип клеток используется для определения инфекционности, вполне вероятно, что присоединение остатков сиаловой кислоты увеличивает степень связывания вирионов с какими-то клеточными рецепторами. В этой связи интересно отметить, что, по предварительным данным, сиализидированные вирионы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, по-видимому, присоединяются ,к куриным эритроцитам так же, как контрольные вирионы (Schulze, неопубликованные данные). Эти результаты указывают на то, что при некоторых условиях гемагглю-тинация является неточным индикатором наличия взаимодействия вирионов с рецепторами эритроцитов, не говоря уже о взаимодействии их с рецепторами хозяйских клеток.

Аналогичные изменения активности могут быть вызваны с помощью обработки вируса гриппа фетуином — гликопро-теидом, содержащим остатки сиаловой кислоты (Der, Schulze, 1975). Контакт вирионов с фетуином приводит к потере ими гемагглютинирующей активности и увеличивает инфек-ционность препарата (табл. 11). Для предотвращения деструкции ингибитора вирусной нейрамияидазой вирусные образцы обрабатывали трипсином перед инкубацией с фетуином. Обработанные трипсином препараты, не обладающие нейраминидазной активностью, теряли гемаатлютинирующую активность и значительно .увеличивали свою инфекционность после инкубации с фетуином. Удаление остатков сиаловой кислоты с фетуином в большой степени снижало его стимулирующее действие и обработанный фетуин переставал быть ингибитором гемагглютинации. Это указывает на то, что

остатки сиаловой кислоты должны участвовать в изменении обеих активностей. Приведенные результаты показывают, что адсорбция вирионов на клетках-хозяевах может быть облегчена путем добавления некоторых водорастворимых глико-протеидов, содержащих в своем составе остатки сиаловой кислоты. Это увеличение инфекционности, так же как и в случае сиализидированных вирионов, может быть связано с образованием агрегатов, которые являются причиной инфекции, как это наблюдается при агрегатах неполных, но комплементационных вирусных частиц (Hirst, Pons, 1973). Независимо от того, какая из этих альтернатив в действительности имеет место, вероятно, настало время пересмотреть наши взгляды на роль сиалосодержащих гликопротеидов в инфекционном процессе, поскольку некоторые из этих молекул, по-видимому, стимулируют инфекцию вместо ее угнетения.

Вне зависимости от того, какой механизм ответствен за потерю гемагглютинирующей активности и увеличение инфекционности, приведенный выше экспериментальный материал подтверждает тот факт, что присоединение сиаловой кислоты к 1гемагглютинину или взаимодействие вируса с сиа-лосодержащими гликопротеидами приводит к возникновению инфекционных, но не агглютинирующих вирусных частиц. Инфекционные вирусные частицы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, наблюдались ранее в персистентно инфицированных культурах клеток (Gavrilov et al., 1972) в результате химиотерапевтической обработки мышей (Mag-rassi et al., 1966) и в процессе адаптации штаммов вирусов гриппа типа А2 к новым клеткам-хозяевам (Thibon et al., 1967). Поскольку ни в одном из этих случаев вирусные частицы не исследовали после их очистки, механизм ингибиро-вания гемагглютинации пока еще не ясен. Thibon и соавт.

(1967) предположили, что в их опытах гемапглютинин на поверхности вириона присутствовал, поскольку он вызывал синтез HI-антител, но был замаскирован. Ингибиторы же вируса гриппа типа А2 в культуральной среде не обнаруживались.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большая часть приведенной в этой главе информации о вирусах гриппа 'была получена на штаммах вируса гриппа типа А. Хотя IB настоящее время имеется мало данных о вирусах других типов, структура НА* вируса гриппа типа В, по-видимому, очень сходна со структурой НА* вируса гриппа типа А (ом. гл. 2 и раздел III этой главы). О вирусах гриппа типа С здесь не упоминалось, поскольку в настоящее время сведения о структуре их НА* полностью отсутствуют.

Нам хотелось бы обсудить некоторые аспекты взаимодействия между вирусным НА* и эритроцитами. Учитывая то, что мы знаем в настоящее время о молекулярной структуре рецепторов эритроцитов и вирусного НА*, можно сделать вывод, что явление гемагглютинации представляет собой взаимодействие между молекулами, которые очень сходны по своему составу и структуре, но резжо отличаются по своим зарядовым свойствам. Каж вирусный НА*, так и вирусные рецепторы эритроцитов являются низкомолекулярными гли-копротеидами, склонными к агрегации после их изоляции. В нативном виде оба тликопротеида имеют специфические места, чувствительные к трипсину, оба гликопротеида имеют гидрофобную часть в области карбоксильного конца молекулы и гидрофильную область у N-конца. Эти свойства характерны для большинства ассоциированных с мембранами гликопро-теидов. Различие между этими двумя молекулами состоит в разном содержании в них остатков сиаловой кислоты. В то время как для гликопротеида эритроцитов содержание сиаловой кислоты составляет 27%, в вирусном гликопротеиде сиа-ловая кислота отсутствует. Поскольку при физиологических значениях рН карбоксильная группа сиаловой кислоты находится в ионизированном состоянии, ионное окружение эритроцита должно значительно отличаться от ионного окружения вирусной частицы.

Многие особенности взаимодействия вируса с эритроцитами могут быть объяснены на основе этих различий в зарядовых свойствах. .В этой связи важно отметить, что адсорбция вирусов на эритроцитах не должна рассматриваться как явление, эквивалентное гемагглютинации. Хотя прикрепление вирусной -частицы к рецептору эритроцита и является необходимым условием гематоглютинации, оно не служит лимитирующим фактором при формировании сетчатой структуры или агрегата. Наличие различных точек зрения на процесс взаимодействия вирусных частиц с эритроцитами несомненно -было связано с тем, насколько мы были в состоянии изучать изолированно процессы вирусной адсорбции и .гемагглютинации. Во многих работах ставится знак равенства между адсорбцией и гемагглютинацией, поскольку в настоящее время еще не разработана методика изучения процесса адсорбции вирусных частиц на клеточную поверхность.

Кроме того, важно сознавать, жак мало мы знаем о химическом составе вирусных рецепторов, локализованных на клетках-хозяевах и играющих роль в инфекционном ироцессе. Естественно, однако, предполагать, что эти рецепторы резко отличаются от рецепторов эритроцитов. Гликопротеид эритроцитов человека содержит больше остатков сиаловой кислоты, чем гликопротеид плазматических клеточных мембран (Spiro, 1973). и его удельный вес в общем белковом содержании эритроцитов больше, чем удельный вес любого из гли-копротеидов плазматических мембран (Hughes, 1973). В то время как все остатки сиаловой кислоты могут быть легко удалены с поверхности эритроцитной мембраны с помощью нейраминидазы (Eylar et al., 1962), в других клетках некоторые из тажих остатков нечувствительны к обработке этим ферментом (Glick et al., 1970). (Предполагается, что эти нечувствительные к нейраминидазе остатки сиаловой жислоты локализованы на гликолипидах (Glick et al., 1970) и вовлечены в процессы адсорбции вируса и проникновения его в клетку (Haywood, 1974). Прикрепление вируса ж клеткам-хозяевам во многих случаях может быть проконтролировано путем -измерения инфекционное™ вирусной суспензии. Как и в случае гемагглютинации, этот метод индикации требует, чтобы осуществлялись все следующие за адсорбцией процессы. Таким образом, адсорбция вируса на клетку-хозяина и на эритроциты включает два независимых процесса и ни один из них не был ранее изучен с помощью таких методик, которые дали бы ответ на интересующие нас вопросы.

В свете всего изложенного хотелось бы отметить, что мы довольно опрометчиво дали название главному поверхностному гликопротеиду вируса гриппа. Для нас он является ге-магглютинином просто потому, что мы можем (количественно изучать процесс именно гемагглютинации, однако в вирусной частице этот гликопротеид играет другую роль. Хотя некорректно выбранное нами название этого гликопротеида и не может изменить его функцию, оно в .какой-то степени влияет на наше восприятие того, каж этот гликопротеид взаимодействует с клетками. Характерные черты гемагглютинина, приведенные здесь, в основном получены на основе экспериментов по определению его гемагглютинирующей активности. В настоящее время имеются более эффективные методики изучения взаимодействия вириона с клетками-хозяевами и

с эритроцитами. Поскольку мы не можем рассчитывать на интуицию, которая помогла бы нам понять сущность явления без кропотливой работы, вполне вероятно, что ,мы лучше поймем наз'начение того 'поверхностного гликопротеида, (Которому мы дали название «гемагглютинин», если не будем пытаться найти прямую аналогию между его взаимодействием с эритроцитами и клеткой-хозяином.



LITTÉRATURE

Ada GL, Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med., 1954, v. 32, p. 453.

Aminoff D. Biochem. J., 1961, v. 81, p. 348.

Bartholomew BA, Jourdian GW In: Methods in Enzymology (EF Newfeld and V. Ginsburg, eds.), New York, Acad. Press, 1966, v. 8, p. 368—372. Bateman J. В., Davis MS, McCaffrey PA Am. J. Hyg., 1955, v. 62,

p. 349. Brand С. М., Skehel JJ Nature (London), New Biol., 1972, v. 238,

p. 145. Burnet FM, McCrea JF Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1946, v. 24,

p. 277. Burnet FM, McCrea IF, Stone JD Brit. J. exp. Path., 1946

Choppin PW, Tamm I. Virology, 1959, v. 8, p. 539. Choppin PW, Tamm IJ exp. Med., 1960, v. 112, p. 921. Chu С MJ gen. Microbiol., 1951, v. 5, p. 739. Cohen A., Belyavin G. Virology

Cohen A., Belyavin G. Abstr. int. Congr. Microbiol., 1966, 9th, p. 379. Compans RW, Dimmock NJ, Meier-Ewert H. In: The Biology of Large

RNA Viruses (RD Barry and BWJ Mahy, eds.), New York, Acad.

Press, 1970a, p. 87—108. Compans RW, Klenk H.-D., Caliguiri LA, Choppin PW Virology, 1970

Der C.-L., Schulze IT In preparation, 1975. Drescher J. Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskr. Hyg., Abt. I: Orig

Drescher I. Am. J. Epidemiol., 1966, v. 84, p. 167. Drescher J, Am. J. Epidemiol., 1967,

Drzeniek R., Seto J. Т., Rott R. Biochim. biophys. Acta, 1966, v. 128, p. 547. Eckert EAJ Bacteriol, 1966, v. 92, p. 430. Eckert EAJ Immunol., 1969, v. 102, p. 1105. Eckert EAJ Virol., 1973, v. 11, p. 183. Eylar EH, Madoff MA, Brody OV, Oncley JLJ biol. Chem., 1962,

v. 237, p. 1992. Fazekas de St Groth S., Gottschalk A. Biochim. biophys. Acta, 1963, v. 78,

p. 248.

Finter NB Virology, 1964, v. 24, p. 589. Francis TJ exp. Med., 1947, v. 85, p. 1. Francis Т., Salk JE Science, 1942, v. 96, p. 499. Francis Т., Salk JE, Quilligan IJ, Jr. Am. J. pub. Hlth, 1947, v. 37,

p. 1013. Frommhagen LH, Knight CA, Freeman N. K- Virology, 1959, v. 8,

p. 176. Gavrilov VI, Asher DM, Vyalushkina SD, Ratushkina LS, Zmieva RG,

Tumyan BG Proc. Soc. exp. Biol., 1972, v. 140, p. 109. Glick M. C, Comstock C, Warren L. Biochim. biophys: Acta, 1970, v. 219.
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин

  1. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions
    RV OIMPSON et VD BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. INTRODUCTION Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, et donc la plupart des informations sont fragmentées dans sa composition de si un grand nombre de problèmes non résolus. La principale déclaration sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus génomiques négatifs.
  2. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase
    D. BOOKER et P. PALEYSE I. BUCHER I. INTRODUCTION L'existence de la neuraminidase a été suggérée pour la première fois dans le travail désormais classique de Hirst (1942). Il a constaté que si les globules rouges agglutinaient en présence du virus de la grippe désagglutiné, alors lorsqu'un nouveau virus leur était ajouté, ils ne pouvaient à nouveau pas s'agglutiner. Cependant, le virus élué ne
  3. Annexe 4 Grippe causée par le virus de la grippe A (H5N1) (grippe aviaire)
    La grippe aviaire est une infection virale hautement contagieuse qui peut toucher toutes les espèces d'oiseaux. Parmi les espèces domestiques, les dindes et les poulets sont les plus sensibles. Les oiseaux sauvages peuvent transmettre l'infection. Le réservoir naturel des virus de l'influenza aviaire (AIV) est la sauvagine, qui est le plus souvent responsable de l'introduction de l'infection dans les ménages. L'étiologie. AHP appartient à
  4. Кильбурн Э.Д.. Вирусы гриппа и грипп (1978), 1978
    Книга посвящена обзору разнообразных вирусов гриппа, их культивированию, биохимии и особенностям молекулярного устройства. Содержание: Вирусы гриппа и грипп. Структура вируса гриппа. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин. Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа. Рибонуклеиновые кислоты вирусов
  5. . Белки вирусов
    3.1.Аминокислотный состав вирусных белков Белок всех исследованных до настоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащих к естественному L-ряду. D-аминокислот в составе вирусных частиц не найдено. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно близко к таковому в белках животных, бактерий и растений. Вирусные белки не содержат обычно большого количества
  6. La culture des virus de la grippe humaine en laboratoire, le cercle d'hôtes parmi les animaux de laboratoire et l'isolement du virus du matériel clinique
    B.R.DAUDLE et G.S. SCHILD aux virus de la grippe (Schafer, 1955). En 1931, Shope passa la grippe porcine «classique» en administrant par voie intranasale un filtrat de sécrétions respiratoires. Premières données sur
  7. Вирусы гриппа и грипп
    Э. Д. КИЛЬБУРН (Е. D. KILBOURNE) I. ВВЕДЕНИЕ. ГРИПП — ЗАБОЛЕВАНИЕ С НЕИЗМЕНЯЮЩЕЙСЯ СИМПТОМАТИКОЙ, ВЫЗЫВАЕМОЕ ИЗМЕНЯЮЩИМСЯ ВИРУСОМ Огромный интерес, привлекаемый в современной вирусологии к гриппу и вирусам, ответственным за его возникновение, требует объяснения, если учесть ординарный характер симптоматики этого, обычно очень умеренного, инфекционного заболевания дыхательных путей
  8. Структура вируса гриппа
    П. В. ШОППИН И Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВВЕДЕНИЕ Изучение вируса гриппа в течение длительного времени находилось «а передовом рубеже структурных исследований в вирусологии. Вирус гриппа одним из первых был изучен: помощью электронной микроскопии (Taylor et al., 1943), и при использовании именно этого объекта в качестве модели было "оказано, что некоторые вирусы
  9. Репликация вируса гриппа
    К. ШОЛТИССЕК и Х.-Д. КЛЕНК (СН. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. ВВЕДЕНИЕ По проблеме репликации вируса гриппа существует ряд обзоров. Литература до 1968 г. обобщена в статьях Hoyle (1968) 'и Scholtissek (1969); более поздними работами являются обзоры White (1973), а также Compans и Choppin (1974). Большинство данных по репликации получено при 'изучении вируса гриппа типа А. Существенных
  10. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  11. Variabilité antigénique du virus de la grippe
    RG WEBSTER et WG LEIVER i (RG WEBSTER et WG LAYER) I. INTRODUCTION Le virus de la grippe de type A1 est unique parmi les agents pathogènes des maladies infectieuses humaines en raison de sa capacité à modifier sa propre structure antigénique au point que l'immunité spécifique acquise la réponse "et l'infection par une souche est très faible ou ne protège pas contre la suivante
  12. Génétique du virus de la grippe
    A. SUGIURA I. INTRODUCTION. REVUE HISTORIQUE Ce chapitre n'est pas écrit pour donner un aperçu de toute la littérature relative à l'étude de la génétique du virus de la grippe. Cela se fait plus en détail dans les revues de Kjlbourne (1963) et Hoyle (1968). J'ai essayé de tracer, en essayant d'adhérer à l'ordre chronologique, uniquement pour les données qui ont directement conduit à des concepts importants et
  13. CLASSIFICATION DES SUBSTANCES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES
    Toutes les substances biologiquement actives ou éléments individuels qui provoquent l'empoisonnement des animaux ou le fonctionnement normal des systèmes corporels individuels, selon leur fonction, sont divisés en un certain nombre de groupes. Pesticides (pestis - nocifs, caedere - tuer). Les pesticides sont des pesticides contre les plantes et les animaux. Pour la toxicologie vétérinaire, ils sont plus importants que
  14. РЕГЛАМЕНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРИНЦИПЫ ИХ НОРМИРОВАНИЯ В КОРМАХ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА
    Для предотвращения отравления сельскохозяйственных и диких животных, в том числе рыб, птиц, пчел, токсическими веществами, применяемыми для обработки растений, почвы, водоемов и животных, а также с целью профилактики загрязнения продуктов питания животного происхождения их остатками устанавливани pel плмопты их безопасного использования и максимально до-iivi'iiiMi.if у|ювни (МДУ) содержания в
  15. INFORMATIONS GÉNÉRALES SUR LES PLANTES MÉDICINALES SUBSTANCES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES DE PLANTES MÉDICINALES CONDITIONNANT LEURS PROPRIÉTÉS DE GUÉRISON
    L'utilisation de plantes médicinales dans la pratique est due à la présence de substances biologiquement actives dans leur composition qui, lorsqu'elles sont introduites dans l'organisme, même en très petites quantités, provoquent un certain effet physiologique. Ces substances actives sont synthétisées par les plantes elles-mêmes à partir de substances minérales inorganiques du sol, de l'eau et du dioxyde de carbone de l'air. La synthèse est réalisée par des plantes sous l'influence de
  16. Pays avec des cas humains de grippe aviaire et plan d'action mondial de l'OMS contre la grippe
    À ce jour, des cas humains ont été signalés dans sept pays, dont la plupart se trouvent en Asie: Vietnam, Indonésie, Iraq, Cambodge, Chine, Thaïlande et Turquie. Chez les premiers patients enregistrés au Vietnam, les symptômes de la maladie sont apparus en décembre 2003 lors de la flambée actuelle, et l'infection H5N1 a été confirmée le 11 janvier 2004. Rapports de Thaïlande
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com