Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

Génétique du virus de la grippe

A. SUGIURA

I. INTRODUCTION. REVUE HISTORIQUE

Ce chapitre n'est pas écrit pour donner un aperçu de toute la littérature relative à l'étude de la génétique du virus de la grippe. Cela se fait plus en détail dans les revues de Kjlbourne (1963) et Hoyle (1968). J'ai essayé de tracer, en essayant d'adhérer à l'ordre chronologique, uniquement pour les données qui ont directement conduit à des concepts et théories importants dans ce domaine. J'ai également essayé de donner de nouvelles explications à certaines des données expérimentales plus anciennes, en utilisant la terminologie maintenant utilisée, et de modifier certaines interprétations antérieures qui se sont avérées intenables, à la lumière des connaissances modernes. L'histoire de la recherche génétique sur le virus de la grippe est divisée en deux périodes. La première phase couvre la quasi-totalité des années 50, tandis que les événements du début des années 60 à nos jours seront considérés comme la deuxième période, dont le début a été noté par l'utilisation généralisée des cultures cellulaires et l'utilisation de la méthode de la plaque.

A. PREMIÈRE RECHERCHE PÉRIODIQUE SUR LA GÉNÉTIQUE

Les premières preuves des interactions génétiques du virus

Des hiboux grippaux ont été obtenus par Burnet et Lind (1949) lors de leurs études

recherche sur le phénomène d'interférence dans le cerveau des souris. Du cerveau, nous

cols infectés simultanément par une variante neurotrope

(NWS) souche WS i d'autres souches non neurotropes,

WSM ou SW-15, ils ont isolé des souches du virus qui étaient

mais a hérité des signes des deux virus introduits, à savoir

possédait une neurovirulence NWS, mais avait

résistant à la chaleur ON WSM, ou type sérologique

souche SW-15. Au cours des 10 prochaines années, Burnet et son

les employés étaient des chercheurs de premier plan dans la génétique du virus

grippe.

En 1951, Henle et Liu ont découvert qu'une infection multiple de cellules allantoïdiennes par la souche PR8 (A) ou Lee (B) de virus grippaux inactivés par le rayonnement ultraviolet ou la chaleur, conduit à une restauration partielle de l'infectiosité perdue. Ils ont interprété ce phénomène comme un analogue de la réactivation multiple dans des bactériophages T-pairs, c'est-à-dire comme une forme d'interactions génétiques entre différents génomes viraux au sein d'une même souche.

En 1952, Appleby a annoncé l'isolement d'une nouvelle souche du virus à partir d'embryons de poulet qui a reçu un mélange de souches NWS et Kunz inactivées par le rayonnement ultraviolet. Ce nouveau virus avait les propriétés sérologiques de la souche Kunz, mais en ce qui concerne le tropisme tissulaire, il se comportait de manière similaire à la souche NWS parent, c'est-à-dire qu'il avait une neurovirulence et une latogénicité lors de l'inoculation intranasale chez la souris. L'apparition de ce virus a été expliquée par recombinaison.

En 1953, Hirst et Gotlieb (1953a) ont commencé à travailler sur la génétique du virus de la grippe, et leur groupe, avec le groupe Burnet, a formé deux écoles principales dans ce domaine dans les années 1950. Parmi d'autres formes combinatoires des souches WSN et Mel Hirst et Gotlieb, le virus Chz a été obtenu, qui a apparemment hérité des antigènes des deux virus parents et s'est révélé stable lors de passages répétés à des dilutions maximales.

En 1955, Baron et Jensen ont découvert que les traits génétiques des souches NWS ou Wright inactivées par les rayons ultraviolets pouvaient être sauvés dans une infection mixte avec des virus actifs. Le virus descendant avait les caractéristiques génétiques de la souche parentale inactive et le sérotype la souche active.

Ainsi, l'existence d'interactions génétiques ou de recombinaisons génétiques a été fermement établie par plusieurs groupes de recherche travaillant indépendamment.

1. Recherche génétique par Burnet et ses collègues

Au début des recherches sur la génétique, NWS était presque exclusivement utilisé comme donneur de propriétés génétiques - une variante neurotrope de la souche WS en raison de sa propriété unique: la capacité de se multiplier dans le cerveau des souris, entraînant une altération de la coordination, la paralysie et la mort après administration intracérébrale. Dans les expériences de Burnet et Lind (1951a), WSM, un dérivé non neurotrope de la souche WS, a été un autre partenaire. En plus de la neurovirulence, NWS et WSM différaient dans la stabilité de HA. L'activité hémagglutinante de NWS a disparu à la suite d'un chauffage à 54 ° C pendant 30 min, tandis que HA WSM a résisté à un chauffage à 62 ° C. Après qu'un mélange de ces deux virus a été introduit dans le cerveau des souris dans des proportions appropriées, les souches virales désignées WS-NM ont été isolées, ce qui s'est avéré neurovirulent pour les souris, bien qu'à un degré différent, mais avait une HA également résistante à la chaleur, comme avec la souche WSM. Ces propriétés sont restées stables pendant au moins deux passages dans des embryons de poulet à des dilutions maximales.

Dans la série d'expériences suivante (Burnet, Lind, 1951b; Burnet, Edney, 1951), plusieurs marqueurs génétiques ont été utilisés pour recombiner la souche NWS avec la souche Mel, une souche non neurotrope appartenant à un sous-type sérologique autre que OTNWS. Des recombinants iurotropes ayant des propriétés sérologiques de la souche Mel (souches NM) ont été isolés du cerveau de souris exposées à une infection mixte. Les virus NM possédaient des caractéristiques de la souche Mel originale, telles que la stabilité thermique de HA et l'agglutination des globules rouges traités avec l'enzyme de destruction des récepteurs (RDE). D'autre part, les recombinants NM ont exercé un effet ferchmeative réduit sur un inhibiteur de l'ovomucine et sont à peine élués des globules rouges. Avec ces propriétés, elles ressemblaient à la souche parentale de NWS. Cependant, contrairement à cette souche initiale, ils sont facilement passés à l'état indicateur1. Ces propriétés des cambinants NM-pe peuvent être expliquées par l'activité NA thermolabile relativement faible et 1 caractéristique de la souche NWS. La souche Mel ne peut pas être convertie à l'état indicateur en raison de la présence de NA stable. La souche NWS ne peut pas non plus être transférée à cet état, mais à cause de son HA thermolabile. Ce n'est que lorsque le HA thermostable de la souche Mel et le NA thermolabile de la souche NWS ont été combinés dans le recombinant NM qu'il a pu passer à l'état indicateur par inactivation différentielle. Dans le NM recombinant, on peut voir une association de caractéristiques génétiques qui a ensuite été développée dans le concept de «groupes liés». Mel [HA (sérotype Mel, thermostable), NA (actif, thermostable) non neurovirulent] -NWS [HA (sérotype NWS, thermolabile), NA '(faible, thermolabile) neurovirulent] -> NM [HA (sérotype Mel, thermostable), NA (faible, thermolabile) neurovirulent].

1 Après avoir réchauffé certaines souches du virus de la grippe (généralement à 56 ° C pendant 60 minutes), la témagglutination pourrait être supprimée à l'aide de certaines muioprotéines, auxquelles le virus réchauffé est insensible. Cette condition est appelée indicateur. La transition vers l'état indicateur est censée être le résultat de l'inactivation de NA.

Depuis 1952, dans des expériences de génétique, plus souvent que NWS, ils commencent à utiliser la souche WSE comme l'un des participants, car elle pousse mieux dans la cavité allantoïde de l'embryon de poulet. La paire de souches WSE et Mel était probablement la combinaison la plus étudiée dans les études de génétique du virus de la grippe. Les données les plus importantes obtenues dans cette série d'expériences peuvent être résumées comme suit.

a) Mélange phénotypique Le virus de remplacement d'une infection mixte, en particulier lorsqu'il a trouvé des recombinants neurotropes NM, a été neutralisé à la fois par des sérums anti-Mel et anti-NWS (Fraser, 1953). Selon Fraser, cet HA anormal était différent d'un simple mélange de souches Mel et NWS et indiquait que la plupart des particules virales avaient des mosaïques antigéniques à leur surface.

b) La capacité d'un virus inactivé à participer aux interactions génétiques. L'inactivation d'un des composants par chauffage à 56 ° C pendant 30 min n'empêche pas l'apparition de recombinants du même type sérologique que dans le composant chauffé (Burnet et Lind, 1954b). Un degré d'inactivation convenablement sélectionné de l'un des composants par chauffage modéré à 37 ° C pendant 7 jours facilite même la détection des recombinants. Cependant, le virus inactivé par l'éther n'a pas pu former de recombinants (Fraser, 1959a).

c) Groupes d'embrayage. Les souches Mel, WSE ou .Y \, différaient par un certain nombre de caractères facilement identifiables (tableau 18). Les signes de la souche Mel ont été désignés ABCDEF, souche WSE abcdef et souche NWS b (c) (d) efg.

Dans ce cas, la procédure de sélection utilisée ne permet pas d'isoler la forme inverse du recombinant. Les traits ABDF, abdf étaient toujours liés (liés) et constituaient ainsi un groupe de cohésion, et les traits CE, ce ou CEG, ceg - un autre. Du point de vue de la théorie actuellement acceptée de la génétique du virus de la grippe, qui suppose que chaque fragment d'ARN code pour un haolipeptide, l'existence de groupes de liaison n'est pas claire à moins que tous les marqueurs liés ne soient supposés être des manifestations phénotypiques différentes d'une protéine codée par le virus. Les données présentées peuvent être interprétées comme suit. ABD et abd sont sans aucun doute des phénotypes de HA *, et 'C et c - • NA * des souches Mel et NWS, respectivement. La raison pour laquelle le HA * de la souche chauffée de Mel n'était pas inhibée par la mucine de salive de mouton pourrait être due à l'absence de l'agent pour cet inhibiteur dans la souche HA * de Mel. D'un autre côté, la souche HA * de Mel pourrait avoir une affinité pour un inhibiteur de l'ovomucine ou du méconium, mais comme son NA est thermostable et capable de détruire ces inhibiteurs même après chauffage, l'inhibition de l'activité d'hémagglutination n'a pas été supprimée dans l'inhibition appliquée de l'agglutination de l'hème. Pour la souche NWS, la situation était contraire. Comme déjà discuté, la propriété C, c représente la thermostabilité NA *. Si cette interprétation est correcte, la capacité de croître dans les poumons des souris a été déterminée par * NWS. Cependant, il convient de noter qu'une liaison spécifique de marqueurs ne se produit qu'avec une combinaison spécifique de souches virales parentales; lors de la recombinaison des souches WSE et CAM, les propriétés F et I ont été héritées indépendamment des propriétés de HA * (Burnet et Lind, 1955). Pour la neurovirulence, la présence de NA * NWS était apparemment nécessaire au moins pour la combinaison de NWS et d'autres souches H0N1 ou HswlNl. Tous les recombinants neurotropes obtenus par Burnet et al. à partir de la souche NWS comme l'un des composants et des souches WSM, SW-15, Mel ou Ocean Island comme d'autres, les phénotypes correspondant à NA * NWS ont été portés (Burnet, Lind, 1951a, b). La variante neurotrope, obtenue indépendamment par Appleby (1952) en croisant des souches de NWS et Kunz, avait également des propriétés cohérentes avec ce modèle. La NK recombinante avait définitivement l'hétérotype Kunz dans l'inhibition de l'hémalglutination, ainsi que dans la neutralisation in ovo, mais a été légèrement neutralisée par l'antisérum en NWS. Concernant le tropisme tissulaire, il était aussi neurovirulent que la souche NWS. Ce recombinant ressemblait à la souche NWS et. sa sensibilité aux inhibiteurs de la salive et sa faible activité enzymatique (neuraminidase). NK a probablement reçu HA * de la souche Kunz et NA * de la souche NWS. Un faible degré de neutralisation par anti-NWS-cbiBOpOT-coy pourrait être une raison pour supprimer la croissance multi-cycle du virus sous la présence constante d'anticorps dirigés contre NA (voir Ch.12).

On pensait que la pathogénicité des embryons de poulet inoculés dans le chorion-allantoïde (propriété e) était étroitement associée à la neurovirulence pour les souris (g) et à la labilité thermique de NA * NWS (c). Cependant, ces deux types de virulence semblent servir de manifestations différentes du même génotype. Fraser (1959d) a comparé la virulence de ces deux hôtes dans différentes souches de recombinants NM isolés à partir du cerveau de souris ou du cerveau d'embryons de poulet. Toutes les souches faiblement pathogènes pour les embryons de poulet se sont révélées légèrement infectieuses lorsqu'elles ont été administrées par voie intracérébrale à des souris. L'auteur a conclu que ces deux pathogénités étaient de degrés différents de la même qualité héréditaire, et la neurovirulence pour les souris ne peut être détectée que si un certain niveau de pathogénicité est atteint pour les embryons de poulet.

d) Haute fréquence de recombinaison. Au cours de ces études, les clones viraux ont été isolés exclusivement à partir d'embryons infectés à la plus haute dilution. Les types mineurs de progéniture virale ne pouvaient généralement pas être obtenus avant qu'un très grand nombre d'embryons ne soit utilisé. Dans la plupart des cas, les recombinants étaient isolés à l'aide de méthodes de sélection telles que l'utilisation d'antisérum ou l'utilisation d'un système de restriction des cellules hôtes, ou souvent ces deux méthodes Par conséquent, la fréquence de recombinaison ou la proportion de recombinants dans la progéniture virale n'a pas pu être déterminée. Seulement lors du croisement des souches Mel et WSE, lorsque les deux types de virus ont atteint approximativement les mêmes niveaux, la combinaison a été quantifiée (Burnet, Lind, 1952). Après infection des œufs,

dépourvu d'embryons, avec des «concentrations élevées des deux virus suffisantes pour» infecter toutes les cellules à la fois, le virus inoculant a été retiré à l'aide d'une enzyme destructrice des récepteurs (RDE). La culture après un cycle, prise après 6 b / h, a été analysée en isolant les clones viraux aux dilutions maximales et en déterminant les propriétés des clones individuels. Parmi les 41 clones examinés, il y avait 22 Mel, 6 M +, 9 WS ~ et 4 WSE. Ainsi, la fréquence de recombinaison était de 15/41, soit 37%.

e) Redistribution de la virulence. Lorsque la recombinaison entre NWS et Mel a eu lieu dans le cerveau de souris ou dans le chor'ion-allantoïse (embryons de poulet, hôtes sélectifs pour les souches virales neurotropes, les propriétés de (ABDF-ceg) de la souche neurotrophique Mel ont été facilement détectées. Lorsque l'infection mixte a été réalisée dans l'allantoïque les cavités et les clones du virus héréditaire ont été isolés sans processus de reproduction, les souches ayant les propriétés combinées de A-ce ont montré tout le spectre de la neuropathogénicité - de l'absence réelle de virulence à une virulence complète comparable à celle du parent Cependant, ces recombinants à pathogénicité faible ou intermédiaire, bien qu'ils n'aient pas entraîné la mort de souris adultes après l'injection intramusculaire, se sont multipliés dans le cerveau dans une certaine mesure et ont causé des infections mortelles lorsqu'ils ont été inoculés dans le cerveau 2– Souris de 4 jours (Lind, Burnet, 1957). Ces souches étaient au moins partiellement neurotropes. Fraser (1959) a observé une variabilité similaire dans la pathogénicité des recombinants NM lors de leur introduction dans le chorion-allantoïde. Cela variait de la virulence complète, c'est-à-dire l'invasion d'embryons avec des lésions hémorragiques et la mort subséquente, à la production de foyers bien définis sur le chorion-allantoïde, mais sans invasion de l'embryon. Comme indiqué, la pathogénicité pour les embryons de poulet et la neurovirulence pour les souris étaient corrélées. Lorsque l'on utilise la virulence comme marqueur, on rencontre presque inévitablement une telle inconstance de sa manifestation. Burnet et al. appelé ce phénomène la «redistribution de la virulence», et c'était probablement le terme le plus difficile à expliquer en termes génétiques. En introduisant le mot «redistribution», les auteurs pensaient que le degré de virulence était déterminé par le nombre de copies du supposé «gène virulent» contenu dans le génome viral individuel qui sont répliquées et redistribuées indépendamment pendant l'interaction génétique (Burnet et Lind, 1954a) ou le nombre de copies du «gène suppresseur» également supposé » "Dans le cas des mutants avirulents (Lind, Burnet, 1958). Tard

D'autres chercheurs, en revanche, étaient enclins à considérer la virulence plutôt comme une multi-location, sans préciser si cela implique l'existence de plusieurs copies du même gène ou si la virulence a un caractère complexe défini par plus d'un gène. Lors de l'interprétation des études génétiques dans lesquelles la virulence a agi comme marqueur, il est nécessaire de garder à l'esprit les deux circonstances suivantes. Premièrement, la variabilité de la manifestation de la virulence n'est en rien caractéristique des recombinants dérivés de la souche parentale virulente. Même le NWS lui-même est plus ou moins susceptible de changer, à moins qu'il ne se multiplie dans le cerveau des souris (ce qui assure une sélection constante de formes virulentes sur fond de formes moins virulentes) ou passivé dans la cavité allantoïdienne avec une dilution extrême (ce qui soutient les propriétés originales). Dans les passages dans ce dernier cas, avec des dilutions plus petites, il y a invariablement une propagation en direction d'un réseau de neurovirulence plus petit (Burnet, 1951), indiquant qu'il ne donne pas d'avantage à ce virus dans ce système et que les mutations vers moins de virulence sont relativement fréquentes. Deuxièmement, la virulence, contrairement à d'autres marqueurs in vitro (comme le sérotype «si la stabilité thermique de HA *) est une propriété qui ne peut être reconnue qu'après une propagation intensive de virus, et, par conséquent, peut être sujette à des changements à tout moment: multi-cycle croissance du virus. Pour que la virulence apparaisse, chaque étape doit se dérouler avec une efficacité maximale. La moindre incompatibilité entre les différents gènes au sein du génome ou l'introduction d'un gène inapproprié qui n'est pas lié au gène virulent putatif peut augmenter l'efficacité du processus, conduisant à une virulence réduite. A titre d'exemple, on peut signaler la mutation du M + recombinant (ABDF-ce) vers M + d (AbdF'-cE) 1, pour lequel le changement dans le premier groupe de liaison d'ABDF à AbdF '(perte de stabilité thermique de HA *, acquisition d'affinité pour les mucoïdes -му рецептору овец и дальнейшая аттенуация патогенности для легких мышей) сопровождалось утерей патогенности для куриных эмбрионов при инокуляции в хорион-аллантоис — изменениями, затрагивающими вторую группу сцепления (Burnet, Lind, 1957b).

2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb

Hirst и Gotlieb (1953) использовали в своих исследованиях только штаммы Mel и WSN. Последний являлся нейро-тропным 'вариантом штамма WS, эквивалентным NWS, «о из другого источника. Смешанные инфекции изучали в аллая-тоисной полости куриных эмбрионов. Далее будут суммированы важнейшие результаты, полученные указанными авторами. Форма XI являлась результатом фенотипического смешения.

Х2: эта форма также подвержена двойной нейтрализации, как и XI, но отличается от XI тем, что при предельных разведениях (наличие одной инфекционной частицы) дает рост потомства, содержащего штаммы Mel и WSN, а, кроме того, иногда еще и Х2. Следовательно, форма Х2 может размножаться по крайней мере в течение нескольких генераций при предельных разведениях без изменения своего характера, но в конце концов может ликвидироваться. Считали, что она является следствием гетерозигозиса или диплоидии.

ХЗ: только один штамм этой формы был получен во всей серии опытов, включающей более 20 пассажей формы Х2. Форма ХЗ, по-видимому, была истинным и стабильным реком-бинантом, который давал продуктивное потомство (в течение по меньшей мере 5 пассажей при предельных инфицирующих разведениях) без увеличения выхода Mel или WSN. Анти-WSN-сыворотка резко тормозила гемагглютинацию ХЗ, но в отличие от XI или Х2 анти-Ме1-сыворотка ингибировала ХЗ слабо, т. е. только при очень больших концентрациях (табл. 20). Отсюда был сделан вывод, что ХЗ несет две ан-

тлгенные специфичности: основной антиген, полученный от штамма WSN, и минорный антиген, полученный от штамма Mel. Ретроспективно представляется вероятным, что ХЗ был реком'бинантом, содержащим НА* штамма WSN и NA* штамма Ме.1; слабое ингибирование анти-Ме1-сывороткой объяснялось стерическим эффектам (см. гл. 12). Нейтрализация ХЗ in ovo анти-Ме1-сывороткой в большей степени, чем ожидалось из ее титра в реакции торможения гемагглютинации, также согласуется с приведенным предположением, поскольку продолжительное присутствие антител, направленных против NA*, может снижать выход вируса до уровня, более низкого, чем тот, который можно определить по гемагглютина-

ции. Это создает видимость большей степени нейтрализации, чем есть в действительности (см. гл. 12).

б) Поведение маркера нейровирулентности. При исследованиях рекомбинации между WSN и Mel авторы использовали только два маркера: наличие или отсутствие нейровирулентности для мышей и серологический тип. Как было обнаружено, рекомбинанты оказались очень асимметричными. В то время 'как рекомбинанты WS-типа, утратившие нейро-вирулентность (W")1, обнаруживались без труда, противоположный тип, т. е. нейровирулентный Mel (M+), не встречался (Hirst, Gotlieb, 1955). Только при реактивации штамма Mel, инактивированного ультрафиолетом, инфекционным штаммом WSN было выявлено существование рекомбинантов М+, хотя нейровирулентность некоторых рекомбинантов была нестабильной и менялась от пассажа к пассажу (Gotlieb, Hirst, 1956). Однако некоторые штаммы потомственного вируса Mel-типа, ненейровирулентные при прямом интраце-ребральном введении мышам, являлись, как было показано, потенциально или стенотипически нейровирулентными, поскольку их скрещивание с W~ — иенейровирулентным реком-бинантом — приводило к образованию несомненно нейротроп-ного WSN. Этот феномен аналогичен перераспределению вирулентности, наблюдавшемуся в 'исследованиях Burnet и соавт. (раздел IA, 1д). Вирулентность рекомбинантов М+ изменялась от полного отсутствия до почти эквивалентной штамму WSN, причем доминировали невирулентные формы. В фенотипичеоки невирулентном рекомбинанте М+ ген нейро-вирулеятности, по-видимому, имел препятствие для своего проявления при комбинировании с серотипом Mel. Только при его рекомбинации с серотипом WS вирулентность восстанавливалась до уровня последнего.

в) Роль гетерозигот в рекомбинации. В ряде опытов смесь вирусов Mel (М~) и WSN (W+), -каждый при высокой концентрации, инокулировали в аллантоисную полость целых куриных эмбрионов или оплодотворенных яиц (Hirst, Gotlieb, 1955). Клоны выделяли при предельном инфекционном разведении (разведение, при котором 25% эмбрионов или меньше оказываются зараженными) из смешанных урожаев вируса без использования антисыворотки в целях селекции. Из 220 выделенных клонов при дальнейших пассажах 85 давали урожай только М-типа, а 58 — только W-типа. Оставшиеся 77 клонов давали начало обоим типам (М и W) при следующей генерации. Эти клоны были, следовательно, серо-типическими гетерозиготами или, более точно, диплоидами,

ибо так называемые гетерозиготы часто являются гетерозиготными по нескольким факторам. Потомство W-типа, полученное из таких гетерозигот, содержало поразительно высокую долю ненейровирулентного WSN [(W~) рекомбинанта относительно серотипа и нейровирулентности], а именно 41 клон из 77. В противоположность этому только 2 из 58 гомозиготных клонов W-типа были W~. Hirst и Gotlieb (1955) предположили, что гетерозиготы являются предварительной стадией, приводящей к образованию рекомбинантов. Так как гетерозиготы тоже были фенотилически смешанными, т. е. подверженными двойной нейтрализации, использование антисыворотки для целей селекции определенного типа потомства сильно снижало шансы обнаружить рекомбинанты. В данных исследованиях этих авторов доля гетерозигот обычно была очень высока (в описанных выше опытах — 77/220, или 35%). С другой стороны, Lind и Burnet (1975a) обнаружили гетерозиготы в меньшей пропорции: три серотипические гетерозиготы в 24 клонах, выделенных при скрещивании штаммов NWSE и Mel. Более того, они выявили высокую долю рекомбинантов и не считали, что гетерозиготы играют сколько-нибудь значительную роль в их производстве. Почему возникло такое расхождение в результатах, полученных двумя группами авторов, объяснить нельзя. Существование гетерозигот само по себе сомнительно, особенно в свете недавних полученных данных об универсальном феномене существования агрегатов вирусных частиц '(Hirst, 1973). Представляется, что роль гетерозигот или агрегатов в формировании рекомбинантов остается пока невыясненной.

В течение первого периода исследований отсутствие точных методов подсчета инфекционного вируса и надежных способов получения чистых клонов являлось главным препятствием на пути к прогрессу. Инфекционность приходилось измерять путем титрования в аллантоисной полости куриных эмбрионов, а единственным практическим способом .получения чистых клонов было использование повторяющихся пассажей при предельных инфицирующих разведениях опять-таки в аллантоисной полости. Любые сколько-нибудь значительные опыты требовали огромного количества эмбрионов. Burnet сам описал эту ситуацию. После 10-летнего изучения рекомбинации вирусов гриппа и многих попыток свести эти явления в удовлетворительную модель (некоторые из этих попыток были опубликованы) автор был вынужден отступить на почти нигилистические позиции. Во всех количественных экспериментах непостоянство результатов таково, что для данных по обнаружению, например, линейной последовательности генетических детерминант определенных свойств были бы необходимы столь обширные опыты, которые превышают возможности любой лаборатории, интересующейся подобной

проблемой. Возможно, сейчас есть смысл всем группам, интересующимся генетикой вируса гриппа, прекратить публикацию статей на эту тему. Нет сомнения во всех получаемых фактах, но отсутствует теоретическая основа, в рамках которой они могут быть представлены (Burnet, 1960).

Однако, несмотря на ограничения, замечательно то, что эти ранние работы оказали существенное влияние на дальнейшие исследования. Почти все основные концепции, все еще распространенные сейчас,—фенотипическое смешение, гетерозигозис, сцепленные группы, высокая частота рекомбинации, генетическая компетентность инактивироваиного вируса — были сформулированы уже в тот период.

Б. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ГЕНЕТИКЕ ВО ВТОРОМ ПЕРИОДЕ

Второй период начался работой, проведенной Simpson и Hirst (1971), которые впервые применили метод бляшек в исследованиях генетики вируса гриппа. Несмотря на плодотворное использование ими культур клеток и метода бляшек и последующие технические усовершенствования, прогресс в этой области ограничивался разборчивостью большинства штаммов вируса гриппа по отношению к культурам клеток в отличие от других вирусов, которые легче могут быть адап- ri тированы к культурам клеток. Эта проблема, беспокоящая нас и сегодня, является причиной пристрастия исследователей в работах по генетике к вирусам WSN, NWS и к вирусу чумы птиц (ВЧП), которые хорошо образуют бляшки во многих системах культур клеток. Поскольку изыскания этого периода являются по существу исследованиями нынешнего дя-я и едва ли нуждаются в детальном описании и переосмыслива-нли, основные достижения будут суммированы лишь в весьма сжатом виде.

Simpson и Hirst (1961) использовали штамм WSN как донор бляшкообразующих свойств для других штаммов вируса гриппа типа А, не образующих бляшек совсем или образующих их плохо с очень низкой эффективностью на клетках куриного эмбриона. WSN давал урожай с высоким титром и образовывал большие и четкие бляшки с эффективностью, почти равной эффективности заражения эмбрионов в аллан-тоисную полость. Смешанная инфекция клеток куриного эмбриона вирусом WSN, инактивированным ультрафиолетовым облучением, и штаммами инфекционными, но не образующими бляшек или образующими их плохо, приводит к появлению бляшек в количествах, значительно превосходящих те, которые обусловлены остаточной инфекционностыо WSN. Большинство бляшек, полученных вследствие кросс-реактивации, по своим размерам и морфологии заметно отличались от бляшек, образуемых вирусом WSN. Штаммы вирусов, выделенные из таких бляшек, обычно обладали свойствами, унаследованными от реактивированных, не образующих бляшек, родительских штаммов. Кросс-реактивация оказалась очень эффективным способом получения рекомбинантов и таким путем были получены бляшкообразующие рекомби-нанты многих серотипов: WS, Mel, PR8, FM-1, S-1, Япония 305 и грипп свиней.

В 1962 г. Hirst выдвинул гипотезу, которая должна была послужить основным толчком к дальнейшим исследованиям вируса гриппа. Эта гипотеза состоит по существу из двух отдельных, хотя и взаимосвязанных, постулатов. Во-первых, автор предположил, что количество РНК, содержащейся в геноме вируса гриппа, меняется от частицы к частице. Этот вывод был сделан на основании физической и морфологической 'Гетерогенности, наблюдаемой у вирусных частиц в стандартных препаратах, несовершенства способа созревания вирусов и частого появления гетерозигот. За исключением неполного вируса (феномен фон-Магнуса), обоснованность этого предположения сегодня еще далеко не доказана, что будет обсуждаться в разделе VA, 3. Во-вторых, РНК вируса гриппа существует в виде еубгеномных фрагментов, способных, возможно, полуавтономно реплицироваться и случайно перераспределяться в процессе сборки вирионов. Исходя из размеров РНК вируса гриппа и основываясь на опыте, приобретенном при работе с ДНК-содержащими бактериофагами и полиовирусом, нельзя было ожидать частоты рекомбинации большей, чем 1%, если она имеет тот же механизм. Наблюдаемый значительно более высокий уровень рекомбинаций мог быть объяснен только генетическими воздействиями, происходящими по какому-то необычному механизму. Прототип этой гипотезы можно обнаружить уже в работах 1952 г., в которых предполагались группы сцепления (см. раздел IA, 1'в), а подобный механизм рекомбинации менее точно был определен в работе Burnet (1956). Но разграничения между разными 'Субгеномными фрагментами и множеством копий с одного и того же фрагмента в то время проведено не было. В этой гипотезе определенно был провозглашен лишь экстраординарный механизм генетических взаимодействий. Спустя 4 года гипотеза «дробного генома» была частично подтверждена открытием небольших и гетерогенных фрагментов РНК, экстрагируемых из вируса гриппа (Davis, Barry, 1966), а также множеством биофизических и химических данных, приводящих к такому же заключению (Shatkin, 1971; Young, Content, 1971; Lewandowski et al., 1971; Bishop et al., 1971; Skehel, 1971; Horst et al., 1972; Bromley, Barry,1973).

Tumova и Pereira (1965) использовали метод Simpson и Hirst (1961), но они выбрали вирус чумы птиц (FPV) как

бляшкообразующий вирус, который должен быть реактивирован, и вирус А2 — как реактивант. Все более чем 50 клонов, полученных из реактивированных бляшек, содержали НА FPV. Однако тест на 'Штаммоепецифическую фиксацию комплемента примерно в половине ракомбинантов выявил в дополнение ж FPV-антигену и А2-антиген. Позже А2-антиген, содержащийся в одном из таких антигенных гибридов FPV-A2 (R4), был идентифицирован как NA вируса А2 (Eas-terday et al., 1969).

Одновременно и независимо проведенные эксперименты Kilbourne и соавт. (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbour-ne, 1966; Kilbourne et al., 1967) с рекомбинантами вирусов NSW (H0N1) и RI/5+ (H2N2) убедительно показали с помощью ряда серологических методов легкость получения «антигенных гибридов». Успеху этих экспериментов способствовало применение новой бляшкообразующей системы для вируса гриппа — анеуплоидных клеток человека, клон 1-5С-4 (Sugiura, Kilbourne, 1965). Поскольку м'ногие штаммы, включая NWS, образуют бляшки на этой линии клеток, можно было подсчитать все типы потомственного вируса, образующегося при смешанной инфекции, что позволяло определить частоту рекомбинации. При использовании двухфакторного скрещивания, включающего вид оеротила и тип бляшек, было показано, что частота рекомбинации достигает 34% после одноциклового роста штаммов NW.S и 'САМ, что подтверждало данные, полученные ранее Burnet и Lind (1952) (см. раздел IA, 1г) i(Sugiura, Kilbourne, 1966).

В этой системе с помощью феномена уменьшения размера бляшек было выявлено существование двух видов антигенов на поверхности вируса (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbourne, 1966); это было сделано при изучении свойств вируса Х7 — антигенного гибрида, полученного путем скрещивания вирусов NWS и A2/RI/5+/57. Антисыворотка к NWS или к RI/5, включенная в агаровое покрытие, оказывала существенно разное влияние на образование бляшек вирусом Х7 на клетках клона 1-5С-4. В то время как анти-NWS-cbiBO-ротка либо полностью предотвращала появление бляшек, либо уменьшала как количество, так и размер бляшек, выявляющихся при конечных разбавлениях (ингабирование бляшек), анти-Ш/б-сыворотка заметно уменьшала лишь размер бляшек, не влияя на их число, в широком диапазоне концентраций сыворотки ' (уменьшение размера бляшек). Анти-Ш/5-сыворотка практически не влияла на Х7 в реакции нейтрализации перед инокуляцией и не подавляла гемагглютинации вируса Х7. AHTH-NWS-сыворотка, с другой стороны, нейтрализовала инфекционность и подавляла гемагглютинацию. Вирус Х7, помимо НА*, полученного несомненно, от NWS, содержал 'антигенную детерминанту,

полученную от вируса А2. Ранее было показано, что иммунизация мышей вирусом Х7, известным тогда как вирус X (Kilbourne, Schulman, 1965), обеспечивает защиту против введения любого из родительских вирусов. То, что А2-антиген в действительности являлся NA*, было доказано Laver и Kilbourne (1966) путем злектрофоретического анализа вирусных структурных белков.

После Х7 Kilbourne (1968) аналогичным образом получил несколько рекомбинантов, содержащих НА* вируса гриппа свиней и NA* вирусов гриппа человека. Эти результаты вместе с отмеченными выше данными Tumova и Pereira (1965) привели к заключению, что способность к рекомбинации универсальна для всех вирусов гриппа А независимо от видов хозяина, из которых они были выделены.

¦Выявление NA* как компонента, антигенно отличного от НА*, и существование рекомбинации по этим двум компонентам является, вероятно, основным вкладом генетических экспериментов в выяснение структуры 'вириона, но в сочетании с обнаружением генетической совместимости между вирусами человека и животных, также я в понимание экологических свойств вируса гриппа (см. гл. 9 и 16).

В течение (многих лет почти все исследования по генетике проводились с использованием природных штаммов вирусов, отличающихся по ряду 'биологических свойств. Обусловлено ли выявляемое отличие одним геном или оно полигенно по своей природе, —было неизвестно. Более того, хотя для вируса гриппа пригодно, по-видимому, множество маркеров, большинство из них служило, вероятно, проявлением действия лишь нескольких генов, в частности тех, которые имеют отношение к белкам поверхности вириона. Изменения в белках, находящихся внутри оболочки, не могли быть распознаны. Fenner и Sambrook (1964) указали на недостатки такого подхода и подчеркнули важность применения условно-летальных мутантов, которые -были успешно использованы в генетике бактериофагов. Это — мутанты, которые не дают инфекционного потомства при определенных, легковоспроизводи-мых условиях, но которые реплицируются нормально или почти нормально при других условиях. Теоретически можно было бы получить мутанты, лишь на один шаг отстоящие от родительского штамма или дикого типа вируса. Из-за отсутствия в клетках животных супрессорчувствительных механизмов (Fenner, 1970) большинство условно-летальных мутантов из вирусов животных являются темлературочувствитедь-ными.

Первое выделение температурочувствительных условно-летальных (ts) мутантов было описано Simpson и Hirst (1968).' Между определенными парами этих мутантов наблюдались как рекомбинация, так и комплементация, и они были

раз-биты «а пять жомллементационных групп. Эта была другая поворотная точка в исследованиях генетики вируса гриппа. С тех лор различные группы исследователей выделили многие ts-мутанты, но они будут описаны далее.

II. ГЕНОМ ВИРУСА ГРИППА

Поскольку об РНК вируса гриппа и ее репликации более подробно говорится в гл. 6 и 8, далее 'будут обобщены лишь те аспекты, которые минимально необходимы для понимания генетики. Генетическая информация для продуцирования инфекционного вирусного потомства закодирована в вириовной однонитчатой РНК. Известные в настоящее -время полипептиды, синтезируемые в клетке, зараженной вирусом гриппа А, приведены <в табл. 21 (White, 1974) (см. также гл. 2). Нали-

чие полипептидов Р2 и NS2 должно 'быть еще подтверждено. Полипептиды НА и NA после трансляции гликозилируются. Полипептид НА может перед включением в вирион разделяться на HAi и НАг путем протеолитичеокого расщепления в зависимости от клетки-хозяина или окружающих условий (см. гл. 3). Ферментативно активная NA*, как известно, является тетрамером, но имеющиеся данные о составе тетра-мера ложа еще противоречивы: состоит он из четырех идентичных субъединиц (NA) или из двух молекул, каждая из которых содержит две различные субъединицы (NAi и NA2) (см. гл. 4). Следовательно, минимальное число полипептидов, кодируемых вирусным геномом, должно быть равно шести

(Р, НА, NP, NA, М и NS), а максимальное — девяти -(Рь Р2, ПА, NP, NAb NA2, M, NSi и NS2). Кодирование этих 6— !> продуктов деятельности генов требует размеров онРНК от 4-Ю6 до 5-Ю6. Электрофоретический анализ РНК, экстрагированной из вириона, поддерживает предположение, что она существует в виде по меньшей мере пяти, а максимально —¦ десяти фрагментов, размер которых находится в пределах 2-Ю5—106. Общее количество РНК, содержащейся в вирионе, находится, как было установлено, в пределах между 4-Ю6 и 5-106 (Shatkin, 1971; Lewandowski et al., 1971; Young, Content, 1971; Bishop et al., 1971; Skehel, 1971; Horst et al., 1972; Bromley, Barry, 1973; см. также гл. 6). Предполагается, что вРНК транскрибируется ассоциированной с вирионом РНК-зависимой РНК-полимеразой в комплементарную РНК, которая также существует в виде гетерогенных фрагментов, аналогичных по размерам фрагментам вРНК. Наиболее достоверные данные позволяют предположить, что комплементарные РНК являются мРНК (Pons, 1972; Kingsbury, Webster, 1973; Etkind, Krug, 1974). На основании приблизительного соответствия между фрагментами РНК и полипептидами не только по числу, но и по размерам (максимальная кодирующая емкость онРНК размером от 2-Ю5 до 10б соответствует полипептидам от 22-Ю3 до 110-Ю3) можно предположить, что каждый фрагмент РНК является моноцистронным (Skehel, 1972). Опыты по гибридизации вРНК и днРНК, присутствующей в зараженных клетках, указывают на то, что большинство фрагментов РНК имеет уникальную последовательность оснований и реплицируется -независимо (Content, Dues-berg, 1971; Bromley, Barry, 1973). Синтез вРНК, вероятно, происходит на матрице комплементарной РНК. РНК-зависимая РИК-полимераза, катализирующая эту реакцию, не охарактеризована, но она, окивидимому, отличается от вирион-ной транскриптазы, блокируемой в зараженных клетках ак-тиномицином D (Bean, Simpson, 1973), тогда как репликация вРНК продолжается, несмотря на присутствие этого антибиотика (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Вероятным кандидатом на роль указанного фермента является РНК-зависимая РНК-полимераза, синтезируемая в зараженной клетке, которая отличается от вирионной транскриптазы по ионам, необходимым для реакции in vitro (Horisberger, Guskey, 1974). Тесная связь NP-субъединиц как с вРНК, так и с комплементарной РНК указывает на то, что именно рибонуклеопро-теин, а не свободная РНК, играет важную роль в качестве реплицирующейся и функциональной формы вирусного генома (Duesberg, 1969; Pons, 1971, 1972). Сохранение в клетках в течение 16—17 ч способного к реактивации генома, не инак-тивируемого 'внутриклеточной рибонуклеазой (Gotlieb, Hirst, 1956; Kilbourne, I960), также может 'быть объяснено суще-

ствованием его IB виде РНП, который более резистентен к этому ферменту, чам свободная РНК (Pons et al., 1969). Предполагалось, что геном вируса гриппа является -непрерывной структурой, в которой фрагменты РНК удерживаются вместе с помощью белкового остова, образованного субъединицами NP (Pons, 1970). Такой механизм обеспечивал бы определенную степень упорядоченности .при репликации и сборке РНК, предоставив возможность соединения всех фрагментов РНК в процессе созревания.

Вирус гриппа В не изучен так же подробно, как вирус гриппа А. Фактически нет работ о его РНК- Однако в свете ©го морфологического и функционального сходства, подобия структурных компонентов (Laver, Baker, 1972; Oxford, 1973) и сравнимой эффективности рекомбинации (Tobita, Kilbour-ne, 1974) геном вируса гриппа типа В едва ли сильно отличается от генома вируса гриппа А.

(Dulbecco, Vogt, 1958), или слегка ниже скорости приобретения полиовирусом резистентности к гуанидину (Carp, 1963). Дикий тип ВЧП образовывал мелкобляшечный мутант к с необычно высокой частотой (Staiger, 1964). К сожалению, этот феномен не был изучен, и остается неизвестным действительно ли он вызывается мутациями. Определенные химические вещества, изменяющие структуру РНК или мешающие правильному спариванию оснований .в процессе ее репликации, заметно увеличивают частоту мутаций и используются как мутагены. Частота выделения ts-мутантов вируса гриппа при 'Использовании мутагенов или без них не очень отличается от таковой для других вирусов. Впечатление о высокой мута-бельности возникло, вероятно, из необычных эпидемиологических особенностей вируса гриппа, включая частую антигенную изменчивость (ем. тл. 10 и 15).

III. МУТАЦИИ, ИЗМЕНЧИВОСТЬ, АДАПТАЦИЯ

И КОНТРОЛИРУЕМЫЕ КЛЕТКОЙ-ХОЗЯИНОМ

МОДИФИКАЦИИ

А. МУТАЦИИ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Термины «мутация» и «изменчивость» часто употребляют как взаимозаменяемые, но чаще с различными сопутствующими значениями. Мутацию можно определить как изменение наследственного признака, вызв!анное изменением генома. Изменчивость, с другой стороны, обычно подразумевает изменение, являющееся следствием ряда мутаций и последующего процесса селекции, но иногда этот термин включает изменения, не обязательно приписываемые мутации, как при антигенной изменчивости, включая антигенный сдвиг. Антигенная изменчивость или антигенные изменения главным образом поверхностных гликолротеидов, происходящие в природе, будут в полной мере рассматриваться в гл. 10. Не существует экспериментальных данных, доказывающих общепринятое мнение о заведомой лабильности или необычной мутабельно-сти вируса гриппа по сравнению с другими вирусами животных. Пожалуй, с этой точки зрения более неожиданна нехватка данных о мутациях вируса гриппа. В одном из нескольких исследований, посвященных мутациям, уровень мутаций от состояния чувствительности до состояния резистентное™ к р-ингибитору в бычьей сыворотке составлял, согласно расчетам, от 0,7-10~8 до 3,3-10~8 на частицу на одно удвоение в зависимости от штамма .вируса гриппа (Medil-Brown, Briody, 1955). Это равняется приблизительно '/юоо от уровня мутаций, приводящих к d+-npn3HaKy у полиовируса 224

Б. АДАПТАЦИЯ

Адаптация означает получение спонтанных мутантов, часто, но не обязательно, многоступенчатое, и эти мутанты обладают способностью выживанием у определенных хозяев или при определенных внешних условиях, т. е. адаптация —¦ это попытка вызвать изменчивость в направлении, необходимом экспериментатору. Классическим и, вероятно, наиболее изученным примером изменчивости, связанной с адаптацией, является О—D изменчивость (Burnet, 1955). Некоторые штаммы вируса гриппа A (H0N1 и H1N1) при первичном выделении от человека растут только в амниотическои полости куриного эмбриона. Зараженная амниотичеокая жидкость агглютинирует эритроциты человека и морской свинки, но не куриные эритроциты. Вирус с такими свойствами был назван О-вирусом, или вирусом в исходной (original) фазе. В ходе пассирования в аллантоисной полости вирус приобретает способность агглютинировать куриные эритроциты, а не только эритроциты человека и морской свинки. Такое изменение сопровождается приобретением способности размножаться и в аллантоисной полости. Это свойство вируса было отнесено к D фазе или к производной (derivative) фазе. Пассажи О-ви-руса при предельных разведениях поддерживают это свойство, а пассажи при небольших разведениях неизбежно приводят к изменению от О- к D-фазе. Объяснение Burnet и Bull состояло в том, что О-вирус постоянно производит мутант D-формы (с установленной ими -скоростью 10~5 на частицу на удвоение), который лучше, чем О-вирус, приспособлен к росту в данном хозяине и быстрее в нем размножается. Если инфекцию в амниотическои полости инициирует разбавленный заражающий материал, содержащий только О-части-цы, то вирус будет достигать конечного титра до появления

значительного .количества D-форм, и в результате амниоти-ческая жидкость все еще будет сохранять свойства О-вируса. Однако, с другой стороны, если .применять заражающий материал, содержащий также небольшое количество D-частиц, D-форма .постепенно 'будет обгонять в росте О-иирус. Правило, что пассажи при предельных разведениях сохраняют исходные свойства вируса, тогда как пассажи с меньшими разбавлениями ¦благоприятствуют изменениям (появление и доминирование мутантных форм, обладающих при данных условиях преимуществами в выживании), как (было показано, является справедливым и для ряда других случаев, таких, как морфологическая изменчивость вирусных частиц от нитевидных форм .к сферическим (Burnet, Lind, 1957а) или ослабление нейровирулентности штамма NWS при пассажах на эмбрионах (Burnet, 1951).

В. МОДИФИКАЦИИ, КОНТРОЛИРУЕМЫЕ КЛЕТКОЙ-ХОЗЯИНОМ

Модификации, контролируемые .клеткой-хозяином, являются изменениями вирусного фенотипа, определяемыми клеткой, в которой рос вирус. Поскольку все вирусные .полипептиды кодируются геномом вируса, они в равной мере независимы от клетки-хозяина. Однако все углеводы и лилиды, содержащиеся в вирусе, и пути их включения находятся под генетическим контролем клетки.

1. Модификация вирусных гликопротеидов

Гликолротеиды НА и NA частично определяются клеткой, которая поставляет ферменты, необходимые для синтеза углеводов и для гликозилирования полипептидов, кодируемых вирусом. Следовательно, гликопротеиды вирусов из различных клеток могут различаться по электрофоретической подвижности при анализе а полиакриламидном геле и по стабильности при разных диссоциирующих условиях (Haslarh et al., 1970; Schulze, 1970). Более того, общее количество гли Еопротеидов, содержащихся в вирионах, может изменяться в зависимости от клетки-хозяина (Lazarowitz et al., 1973). Высакоочищенный .вирус, выращенныйIB аллантоисной полости, содержит антиген, присутствующий в нормальной аллантоисной жидкости (Knight, 1944). Как было показано, этот антиген клетки-хозяина является высокомолекулярным углеводом, ковалентно прикрепленным к белку, вероятно, к НА* (Harboe, 1963a, b; Haukenes et al., 1965; Laver, Webster, 1966).
Недавнее сообщение предполагает присутствие хозяйского антигена клетки-хозяина также и .в NA:|: (Haheim, Hau-kenes, 1973).

2. Модификация вирусной оболочки

Поскольку оболочка .вируса гриппа и 'близких ему вирусов образуется из плазматической мембраны клетки в процессе отпочковывания, химический состав липидов и гликолипидов оболочки (а следовательно, и вирусных частиц) имеет очень близкое сходство с составом плазматической мембраны (Frommhagen et al., 1959; Klenk, Choppin, 1969, 1970). Вариации в чувствительности вирусной инфекции к фосфолипазе С основаны, по-видимому, на различиях в составе липидов. Вирус, выращенный в аллантоисной полости, -был резистентен к фосфолипазе С, тогда как вирус того же самого штамма, выращенный в культуре клеток куриного эмбриона, — высокочувствительным к ней (Simpson, Hauser, 1966). Антиген груяпы крови и антиген Форсмана, .присутствующие в вирусе, являются гликолипидами, полученными от клетки-хозяина (Rott et al., 1966; Klenk et al., 1972; Haheim, Haukenes, 1973).

3„ Модификации с помощью протеолитических ферментов

Степень, до которой полипептид НА расщепляется перед включением в вирионы на HAi и НА2, часто определяется клеткой-хозяином. Штаммы WSN и RI/5 при выращивании в аллантоисной полости содержат НА, расщепившийся в значительно большей степени, чем при выращивании в первичных клетках почек обезьян (Lazarowitz et al., 1973; см. гл. 3). В случае вируса Сендай расщепление одного гликопептида 'протеолитическими ферментами клетки является, по-видимому, стадией, существенной для приобретения гемолитической активности, способности вызывать слияние клеток и инфек-ционности (Homma, Ohuchi, 1973; Scheid, Choppin, 1974). Для вируса гриппа подобный 'механизм неизвестен. Но в свете того, что добавление протеолитических ферментов в культуры, зараженные вирусом гриппа, значительно способствует многоцикловому росту некоторых штаммов вируса (Came et al., 1968; Tobita, Kilbourne, 1974; Appleyard, Maber, 1974), можно предположить аналогичную ситуацию также и для вируса гриппа.

IV. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

Поскольку проведено большое число исследований по генетике вируса гриппа, было описано и много 'Маркеров. Некоторые являются полезными и до сих пор, но многие из них, по-видимому, будут иметь небольшую практическую ценность в (будущих исследованиях. Независимо от их полезности маркеры, часто употреблявшиеся в прошлом, будут раосмот-

рены здесь с целью выяснения, насколько это возможно, -генетической обоснованности их, исходя из сегодняшних знаний.

А. МАРКЕРЫ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ФЕНОТИПОМ ВИРУСА

1. Фенотипы, относящиеся к гемагглютинину

а) Серотип. Серотип НА* является наиболее хорошо оха

рактеризованным маркером НА*. Он может быть идентифи

цирован различными иммунологическими методами: тормо

жение гемагглютинации, нейтрализация, подавление бляшек

(Jahiel, Kilbourne, 1966) или иммунодиффузия с учетом того,

что антитела к NA иногда вызывают торможение гемагглю-

тинации или нейтрализацию (см. гл. 10). Антигенные гибри

ды внутри самого НА обнаружены не были. Описанные до

сих пор антигенные гибриды, содержащие в неравных пропор

циях оба родительских антигена и выявляемые по подавле

нию гемагглютинации или то реакции нейтрализации (Apple-

. by, 1952; Hirst, Gotlieb, 1953b), были, вероятно, гибридами, которые получили НА* от одного из родительских вирусов, .a NA* — от другого.

б) Термостабильность гемагглютинирующей активности.

При рекомбинации между штаммами WSE и Mel различие

з термостабильноети было приписано НА*, поскольку она бы

ла связана с серотилом НА* (см. раздел IA, 1в). У некоторых

ts-мутантов, обладающих дефектным НА*, гемагглютинирую-

щая активность являлась весьма термолабильной (Ueda, To-

bita, Sugiura, неопубликованные данные). Однако имелись

другие случаи, когда термоетабильность отделялась от серо-

тнпа НА* в процессе рекомбинации (Simpson, Hirst, 1961;

Tumova, Pereira, 1965; McCahon, Schild, 1971), давая основа

ние предположить, что термостабильность гемагглютинирую

щей активности может определяться и некоторыми другими

вирусспецифическими структурными компонентами.

в) Стабильность гемагглютинирующей активности по от

ношению к химическим веществам или ферментам. Стабиль

ность по отношению к додецилсульфату натрия (Simpson,

1964) или к гуанидвнгидрохлориду (David-West, 1973) явля

ется, вероятно, свойством НА*. Но стабильность по отноше

нию к обработке трипсином, т. е. ж протеолитическому отщеп

лению шипов НА* от оболочки, по-видимому, не определяет

ся одним только НА*, так как это свойство может -быть отделено

¦от серотипа НА* ('Kilbourne, 1963; Kilbourne et al., 1972).

г) Сродство к рецептору. Способность вируса агглютини

ровать эритроциты различных видов животных или эритро

циты, обработанные RDE, определяется главным образом

¦сродством НА* к рецептору. Однако видимая гемагглютина-

ция, будучи комбинацией процессов прикрепления вируса к

рецептору и последующей элюции в процессе ферментативного расщепления вещества рецептора, может обусловливаться и NA*. Это можно видеть на примере Х7 (НОШ)-реком-бинанта между штаммами NWS (H0N1) и A/RI/5+/57 (H2N2). Несмотря на неспособность обоих родительских вирусов элюировать с куриных эритроцитов, рекомбинант Х7 быстро элюирует с них. Этот «новый» фенотип, приобретаемый в ходе генетического взаимодействия, получается, по-видимому, из соединения низкого по сравнению с Н2 сродства НО к рецепторам эритроцитов с высокой нейраминидазной активностью N2 (Laver, Kilbourne, 1966). Сродство НА* к определенным рецепторным веществам обнаруживается иногда по чувствительности « этим веществам реакции торможения гемагглютинации. Прогретые препараты WSE были чувствительны к муцину слюнных желез овец, а прогретые препараты Mel нечувствительны. Эти свойства были связаны с ¦серотилом НА* соответствующих вирусов (раздел IA, 1в). Имеются два противоположных типа штаммов вируса H2N2, выделенных в 1957 г., которые резко отличаются по чувствительности к ингибитору, содержащемуся в нормальной лошадиной сыворотке (Choppin, Tamm, 1960). Косвенные данные указывают на то, что это различие присуще НА*, а не NA*, вероятно, вследствие различного сродства гемагглютининов ¦к ингибитору (Choppin, Tamm, 1960; Sugiura et al., 1961; McCahon, Schild, 1971). Интенсивная попытка отделить в процессе генетической рекомбинации чувствительность к ингибитору от серотипа НА* оказалась тщетной (Kiibourne, неопубликованные данные).

Поскольку НА* является продуктом одного гена, то в случае мутации можно наблюдать совместное изменение приведенных выше маркеров (а, Ь, с и d), что подтверждается примером мутации М+ к M+d (раздел IA, 1в).

2. Фенотипы, относящиеся к нейраминидазе

Хотя не решено, состоит NA* из одного или двух типов полипептидо'В, до сих пор нет генетических данных, предполагающих ее двойной генетический контроль. Заметные различия в количествах NA*, приходящихся на вир ион, будут описаны далее (см. раздел IVA, 2г).

а) Серотип. Серотип может быть идентифицирован по ре

акции ингибирования NA*, уменьшению размеров бляшек

или по иммунодиффузии. Иногда его можно выявить также

по торможению реакции гемагглютинацин.

б) Стабильность. Термостабильность может быть провере

на непосредственно in vitro (Drzeniek et al., 1966; Palese

¦et al., 1974). До разработки нейраминидазной реакции in vit

ro в основном для определения термостабильности NA* в ка

честве маркера часто использовали способность фермента

переходить в индикаторное состояние под действием определенного ингибитора прл условии, что /гемагтлютинирующая активность не разрушается при нагревании и что гемагглю-тинил действительно не имеет сродства к упомянутому ингибитору. Было показано, что стабильность по отношению к гуанидингидрохлориду (коррелирует с серотипом NA* (David-West, 1973).

в) Активность фермента. Низкую активность NA* штаммов NWS и WSN, резко отличающуюся от высокой активности других штаммов вируса, часто использовали в качестве маркера (Burnet, Edney, 1951; Appleby, 1952; Burnet, Lind, 1955a, b; Hobson
г) Количество нейраминидазы, вмещаемой вирионом. Существует ряд данных, указывающих на то, что имеется различие в количествах NA*, синтезируемой в зараженных клетках и включаемой в вирион (Webster et al., 1968; Webster, Campbell, 1972; Palese, Schulman, 1974; Mowshowitz, Kilbourne, 1974). Очевидно, это является генетически детерминированным свойством штамма. Удовлетворительного объяснения этого озадачивающего феномена с точки зрения генетики в настоящее время нет.

3. Морфология вириона

Препараты аллантоисной жидкости штаммов вируса, которые не были адаптированы к выращиванию в полости ал-лантоиеа, часто содержат главным образом нитевидные ви-

рионы. Адаптация ж выращиванию в полости аллантоиса сопровождается переходом от нитевидных форм ж сферическим. Однако начальная нитевидная морфология может поддерживаться при пассаже в предельных разведениях (Burnet, Lind, 1957а). Эти данные позволяют-предполагать, что морфология является генетически обусловленной, подверженной частой мутации от нитевидной формы к сферической и что последняя форма по сравнению с первой обладает преимущественным выживанием в полости аллантоиса. Окончательное подтверждение того, что морфология является генетически детерминированной, было получено при проведении опытов по рекомбинации между сферическим штаммом PR8 и нитевидным штаммом вируса А2, приводящей «к появлению в потомстве серотипов: сферического А2 и нитевидного PR8 (Kilbourne, Murphy, 1960). Морфология не связана ни с серотипом НА*, ни с серотипом NA*, но изменение формы от нитевидной к сферической было ассоциировано с увеличенной способностью к росту в полости аллантоиса и более высокой латогенностью для легких мышей (Kilbourne, Murphy, 1960; Kilbourne et al., 1971). Неизвестно, какой вирусный белок (белки) определяет морфологию. На морфологию вириона, кроме того, что она обусловлена генетически, также воздействуют условия окружающей среды. Так, добавление алкоголята витамина А в полость аллантоиса приводит к образованию большого числа нитевидных вирионов PR8, которые были в основном сферическими в отсутствие витамина A (Blough, 1964).

Б. МАРКЕРЫ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСОВ

Для вируса гриппа интенсивно применялись и такие маркеры, как круг хозяев, патогенность или тип бляшек, но они охарактеризованы менее полно, чем маркеры, основанные на фенотипах вирионов. Частично это обусловлено не совсем полным пониманием биохимических стадий репликации вируса, а частично — неизбежно лолигенной природой этих маркеров (в том смысле, что многоцикловый рост вируса требует участия и координации всех продуктов генома, что уже обсуждалось в разделе IA, 1д).

1. Чувствительность к клетке-хозяину

Вирус гриппа может прикрепляться, проникать и инициировать инфекцию в необычайно широком круге хозяев, в отношении как видов животных, так и культур клеток и органов. Однако в большинстве случаев это приводит к абортивной инфекции, т. е. РНК (как комплементарная, так и вирионная) и белки синтезируются, но инфекционного вируса

продуцируется очень мало (Schlesinger, 1950; Isaacs, Fulton, 1953; Henle et al., 1955; Lerner, Hodge, 1969; Haslam et al., 1970; Choppin, Pons, 1970; Sugiura, 1972). Причина абортивной инфекции, по-видимому, проявляет себя в относительно поздней стадии репликации вируса. Неизвестно, одна -и та же ли стадия 'блокируется во всех системах вирус—«летка, приводящих к абортивной инфекции. Абортивная инфекция, в которой миграция РНП-антигена из ядер в цитоплазму нарушена (Franklin, Breitenfeld, 1959; Hills et al., 1960; Loffler et al., 1962; Ter Meulen, Love, 1967; Ghandi et al., 1971), и абортивная инфекция, в которой эта миграция осуществляется нормально (Sugiura et al., 1962; Fraser, 1967; Pristasova et al., 1967; Zavadova et al., 1968; Fedova, Tumova, 1968), могут иметь дефекты в различных стадиях (см. также гл. 8).

Различие между продуктивной и абортивной инфекциями не абсолютно, ибо даже в абортивной инфекции образуется иногда небольшое число 'инфекционного вируса, хотя оно и недостаточно для непрерывного многоциклового роста (Chop-pin, Pons, 1970; Sugiura, Ueda, 1971).

Маркеры чувствительности к клетке-хозяину обычно выявляют по образованию на данных клетках бляшек. Образование бляишк, требующее продукции инфекционного вируса, в количествах, превышающих определенный уровень в каждом цикле многостадийного роста, может являться слишком жестким критерием для маркирования чувствительности к клетке-хозяину. Клоны вирусов, которые в процессе рекомбинации получили ген (гены), необходимый для продуктивной инфекции, 'будут давать различные количества инфекционного потомства, но обычно меньше, чем продуктивный родительский штамм. Это, вероятно, является причиной того, что признак бляшкообразования встречался существенно редко в потомстве, получаемом от скрещивания вирусов, образующих бляшки, с вирусами, не образующими таковых (Tobita, 1971). Сравнение выходов вируса в пересчете на клетку могло бы дать более подходящий критерий для маркирования чувствительности к клетке-хозяину.

При скрещивании FPV со штаммами вируса А2 1957 г. (H2N2) или со штаммом Гонконг (H3N2) для образования бляшек на клетках куриного эмбриона и для вирулентности по отношению к куриным эмбрионам 'был необходим, по-видимому, НА* (но не NA*) FPV (Tumova, Pereira, 1965; McCa-hon, Schild, 1971). FPV, инактивированный ультрафиолетовым облучением или этиленнминохиноном, реактивировался живыми вирусами H2N2 или H3N2. При отсутствии 'селекции в потомстве обычно превалировали маркеры живого родительского штамма. Тем не менее все клоны, выделенные из бляшек, образованных на клетках куриного эмбриона, имели НА* FPV. Наоборот, многие из этих клонов содержали NA*

типа N2, указывающую на то, что NA* EPV может 'быть заменена на N2 без нарушения способности образовывать бляшки (McCahon, Schild, 1973).

2. Патогенность

Является ли вирус патогенным при данном методе введения, зависит от его способности продуцировать инфекционное потомство в клетках в месте инокуляции или вокруг него. Чувствительность к клетке-хозяину и патогенность рассматриваются по существу как один и тот же феномен на различных уровнях. По той же самой причине, следовательно, критерий патогенности, выявляемой по совокупному росту вируса, может быть таким же строгим, ч<ак и образование бляшек в случае маркера чувствительности к клетке-хозяину. Это может также частично объяснить перераспределение вирулентности (раздел IA, 1д). Ранее уже упоминалось о возможной связи нейровн'рулентности с NA* NWS и о патогенности НА* для легких мышей либо NWS либо WSE при рекомбинации штамма Mel со штаммом NWS или WSE (раздел IA, 1в). Mayer и др. (1972) изучали штаммы NWS, А2/Япония/305 и их реком'бинанты (H0N2 и H2N1) с помощью чувствительного теста на нейровирулентность — размножение вируса в мозге иммуносупрессированных мышей. Ни H0N2, ни H2N1 не были вирулентными в той же мере, что и штамм NWS, но оба в отличие от родительского штамма А2 'размножались в мозге до определенного уровня. Авторы заключили, что нейровирулентность не была связана ни с одним лишь НА*, ни с одной лишь NA*. На основании этих данных в сочетании с приведенными выше можно предположить отличие Н2 и НЗ от НО и HI с точки зрения потенции к нейровирулентности. Можно предположить также, что с НА НО и HI ассоциирована неполная, но скрытая нейровирулентность, т. е. способность к ограниченному размножению в мозге; объединение с NA* штамма NWS позволяет вирулентности проявиться полностью. С другой стороны, НА* Н2 и НЗ не ассоциированы с ростам. Введение NA* штамма NWS приводит лишь к небольшому увеличению роста 'вирусов.

Приведенный постулат объясняет, почему нейровирулентность была связана с NA* штамма NWS при скрещивании штаммов Mel с NWS, тогда как эта нейровирулентность находилась под двойным генетическим контролем при скрещивании штаммов А2 и NWS. Подтверждением этих положений является обнаруженная теми же авторами способность к росту в мозге мышей штамма GAM (H1N1), хотя и в ограни-ченой степени, а также наблюдавшийся тоже ограниченный, но вполне определенный рост штамма Mel в мозге очень молодых мышей (Fraser, 1959b).

Более сложно обстоит дело с патогенноетью для легких мышей после интранаэального введения вируса. Большинство штаммов вируса гриппа, вероятно, наделено .потенциальной патогенноетью, TaiK как они могут быть легче адаптированы ж легким мышей, чем к их мозгу. Встречались случаи, когда вирулентность для легких .мышей была, по-видимому, связана с" НА* (MelxWSE или NWS, Burnet, Lind, 1952), с NA* (WSExCAM, Burnet, Lind, 1955; WSExSW, Burnet, Lind, 1956) или ни с тем, ни с другим (A2XPR8, Kilbourne, Murphy, 1960; ГонконгXPR8, Kilbourne et al., 1971; А/Анг-лия/939/69хРК8, McCahon, Schild, 1972). Какой из продуктов деятельности генов 'более способствует росту данного штамма вируса в легких мышей, может зависеть от комбинации штаммов вируса.

В разделе IVB, 1 уже упоминалось о связи летальности для куриных эмбрионов с НА* ВЧП при скрещивании его с вирусом Гонконг.

3. Способность к росту в полости аллантоиса куриных эмбрионов

4. Тип бляшек

Размер и морфология бляшек — с виду очень удобные маркеры, но они охарактеризованы неполно. Механизм и генетические основы их проявления совершенно неизвестны. Увеличенная окр а шив а ем ость нейтральным красным клеток, зараженных определенными штаммами вируса, приводящая к образованию бляшек с 'красной границей (r-признак; Su-giura, Kilbourne, 1966), обусловлена, как полагают, активацией лизосомальиых ферментов и, следовательно, особенностями инициации цитопатичеекого действия (Allison, Malluc-ci, 1965).

В. УСЛОВНО-ЛЕТАЛЬНЫЕ МУТАЦИИ

a. Температурочувствительные (ts) мутанты. Данные мутанты обеспечивают исследования ,по генетике вирусов животных наиболее удобными маркерами. Обсуждению ts-му-тантов отведено в дальнейших разделах так много места, что далее будут отмечены лишь те особенности ts-мутантов, которые резко отличают их от других маркеров.

1. Геном ts-мутантов может быть идентичным геному ви

руса дикого типа, за исключением одного локуса. Для таких

мутантов вопрос о совместимости генов или о полигенной природе маркера не должен возникать.

2. Мутации могут иметь место, по крайней мере теорети

чески, во всех генах. Следовательно, использование ts-мутан

тов может значительно расширить границы генетического

анализа, возможно, до размеров целого генома.

3. ts-мутанты могут обеспечить сильное разрешение, если

они ревертируют достаточно редко и не являются текучими.

Если продуктивная и абортивная инфекции различаются по

выходу вируса примерно в 100 раз (Sugiura et al., 1969;

Choppin, Pons, 1970), то некоторые ts-мутанты проявляют

более чем 106-кратное отличие при разрешающей и неразре

шающей температурах.

b. Мутанты, чувствительные к клетке-хозяину. Мутанты, чувствительные к клетке-хозяину, для вируса гриппа обнаружены не 'были. Их выделяли из вируса везикулярного стоматита, который во многих отношениях напоминает вирус гриппа (Simpson, Obijeski, 1974). В свете возможности участия генома клетки-хозяина в репликации вируса (Borland, Mahy, 1968; Mahy et al., 1972) и заметной зависимости успешного созревания от клетки-хозяина, ino-видимому, заслуживает поощрения попытка отыскать аналогичные мутанты и для вируса гриппа.

Y. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

А. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

1. Рекомбинация вирусов гриппа типа А

Для того чтобы изучать генетическую рекомбинацию с количественной точки зрения, в экспериментах должны быть выполнены следующие условия.

1. Смешанная инфекция должна проводиться в условиях

примерно равной репликации обоих вирусных штаммов.

2. Все клетки, присутствующие в системе, должны быть

заражены одновременно обоими вирусными штаммами. Ино-

кулирующий вирус должен ;быть полностью, насколько это

возможно, удален до появления потомственного вируса.

3. Потомственный вирус должен быть проанализирован

на такой системе хозяйских клеток, в которой все инфекци

онные частицы потомственного вируса могут быть зарегист

рированы.

4. Маркеры должны быть четко охарактеризованы и иден

тифицированы с полной определенностью.

Введение вируса в высокой концентрации, необходимой для одновременного заражения всех клеток вирусами обоих типов, неизбежно приводит в большей или меньшей степени

к появлению феномена фон-Магнуса. Следовательно, интерпретировать результаты необходимо всегда, исходя из .предположения, что инфекционный вирус генотипически отражает (по крайней мере в отношении применяемых маркеров) тотальный потомственный вирус, состоящий главным образом из неполного вируса.

Среди исследований рекомбинаций, 'когда используют природные штаммы вируса, примерно в соответствии с изложенными требованиями, были проведены эксперименты, описанные Tobita (1971, 1972). Смешанную инфекцию проводили на линии клеток конъюнктивы человека, «лон 1-5С-4 (Kilbourne, 1969), штаммами NWS (H0N1) и Гонконг (H3N2), .которые примерно с равной эффективностью образовывали на этих клетках бляшки. Клоны потомственного вируса случайно выделяли из бляшек, образованных на тех же клетках при отсутствии селектирующего давления; у них определяли серо-ТЙП НА* -и NA*. Данные о частоте появления четырех возможных генотипов среди 191 потомственного клона, полученные в четырех отдельных опытах, приведены в табл. 22.

Полученные таким образом результаты ясно указывают на существование или несуществование рекомбинационных событий среди мутантов. Между мутантами с относительно низким уровнем реверсий и с малой степенью текучести рекомбинации либо происходят с частотой, меняющейся от 2 до 33%, либо не определяются (не превосходят 0,02%)- Мутанты могут быть разбиты на группы, или кластеры, в пределах которых не происходит рекомбинация. Подразумевается, что такая картина рекомбинации имеет место главным образом в результате обмена фрагментами генома. Результаты, полученные Mackenzie (1970), которые он считал указывающими на линейность карты вирусного генома, также совместимы с приведенной схемой. Они показывают, что мутанты разбиваются на пять кластеров, внутри которых рекомбинаций не происходит (за некоторыми исключениями), но между которыми обнаруживаются рекомбинации с частотой более 2%.

Существование внутригенных рекомбинаций, идущих по механизму кроссинговера, в настоящее время не может быть полностью исключено. Но если они происходят так же, как в полиовирусе (Cooper, 1969; Cooper et al., 1971), то при сравнении размеров генома полиовируса и фрагментов РНК вируса гриппа можно получить, что частота таких рекомбинаций не превышает 0,3%. Рекомбинации такого порядка

должны бы легко обнаруживаться при соответствующем подборе its-мутантов. )Пока данные, предполагающие существование внутригенных рекомбинаций, отсутствуют.

Sugiura и соавт. (1972) не обнаружили расхождений между данными по рекомбинации и по 'комплементации. Это поддерживает предположение, -что (Каждый субгеномный фрагмент является моноцистрО'ННым (Skehel, 1972). С другой, стороны, Simpson и Hirst (1968), а также С. Г. Маркушин. и Ю. 3. Гендон (1973) описали определенные комплементи-рующие пары мутантов, рекомбинация между которыми отсутствует. Разночтения между рекомбинацией и комплементацией, предполагающие либо внутригенную комплементацию,, либо присутствие двух генов в одном фрагменте РНК, должны быть разрешены в 'будущих исследованиях.

Нередко частота рекомбинации заметно меняется от опыта к опыту. Для одной и той же пары мутантов при предположительно одинаковых условиях экспериментов различия могут быть в 30 раз (Mackenzie, 1970; Hirst, 1973) или в несколько раз (Sugiura et al., 1972). Согласно данным Mackenzie (1970), добавление к 'культуральной жидкости после адсорбции вируса RDE стабилизирует частоту рекомбинаций.. Он также ввел во все опыты одно и то же стандартное скрещивание и, используя RDE и соотнося наблюдаемую частоту рекомбинации определенной пары с аналогичной величиной, полученной для стандартного скрещивания, смог свести разброс данных « минимуму. Достигнутая таким образом воспроизводимость позволила Mackenzie 'продемонстрировать аддитивность частоты рекомбинации между рядом мутантов и сконструировать линейно организованную карту генома. Однако та же техника не имела успеха в системе, использованной в работе Hirst (1973). В настоящее время окончательно ответить на вопрос, линейно или нет организованы гены, — нельзя.

Другой существенной, постоянно наблюдаемой особенностью рекомбинации является то, что множественность инфекции может быть в значительных пределах снижена без заметного уменьшения частоты рекомбинации (Simpson, Hirst, 1968; Mackenzie, 1970; Sugiura et al., 1972; Hirst, 1973). При множественности каждого вируса, равной '/ю БОЕ/клет-ку, когда только 5% всех зараженных клеток получают сразу оба вируса, частота рекомбинации должна падать до V20 от максимального уровня. Однако в действительности она уменьшается менее чем 'вдвое (Sugiura et al., 1972). Это можно объяснить лишь исходя из предположения о присутствии частиц, которые не являются инфекционными в обычном смысле, но способны приводить к появлению инфекционных рекомби-нантов 'вследствие генетического взаимодействия с другим вирусом (раздел VA, 3).

Рекомбинация между штаммами Lee и Mil вируса гриппа типа В 'была показана в работах Perry и Burnet (1953), а также Perry и соавт. (1954). Они получили рекомбинанты, которые содержали НА* типа Mil, выявляемый по серологической специфичности, термостабильности и сродству к рецептору, но наследовали от штамма Lee патогенность для легких мышей и реципрокные рекамбцнанты, авирулент-ные Lee.

Tobita и Kilbourne (1974) заражали «летки куриного эмбриона штаммом Lee и штаммом В/Массачусетс/1/71, антиген-'но отличным от Lee как по НА*, так и ло NA*, и наугад выделяли бляшки, которые развивались в отсутствие селектирующего давления. В клонах определяли оеротипы НА* и NA*. Изученный 31 клон разбили на следующие типы:

Hi.ee — NLee 3 клона

Hjviass — NMass 8 КЛОНОВ

HLee — NMass 2 КЛОна

Hjviass — NLee . .18 клонов.

Двадцать из 31 клона (64%) являлись рекомбинантами по двум поверхностным антигенам. Таким образом, вирусы гриппа типа В не отличаются от вирусов гриппа типа А в отношении высокой частоты рекомбинации.

Несмотря на эффективную рекомбинацию вирусов внутри как типа А, так и типа В, межтиповых рекомбинантов получить не удается.

3. Механизм рекомбинации

Известные в настоящий момент особенности рекомбинации вируса гриппа имеют разительное сходство с особенностями рекомбинации реовирусов. Статистический анализ частоты рекомбинации между ts-мутантами реовирусов свидетельствует в пользу случайного группирования элементов генома. В случае вируса гриппа убедительные данные для такого заключения пока отсутствуют.

Вопрос о том, как осуществляется рекомбинация, является существенным для выяснения лути, по 'которому происходит сборка фрагментов РНК, а также для выяснения вопроса о существовании или отсутствии какого-либо направленного процесса, обеспечивающего сборку всех фрагментов РНК-Согласно одной гипотезе, сборка является сугубо случайным процессом (Hirst, 1962, 1973). При этом наряду с частицами, содержащими полный набор фрагментов РНК, неизбежно должно продуцироваться большое число дефектных частиц. Такие дефектные частицы, попадая в одну и ту же клетку,

должны комплементировать друг с другом, продуцируя инфекционный потомственный вирус. Согласно данным Hirst (197ц), а также Hirst и Pons (1973), если смесь двух штаммов вируса три 'относительно высокой концентрации выдерживают в течение определенного времени, а затем разводят и наносят на клетки, доля клеток, подвергшихся двойной инфекции, оказывается гораздо выше, чем в том случае, если смесь разводят сразу же после слияния двух вирусов или оба вируса разбавляют перед смешением. После достаточно продолжительного периода инкубации при 4 °С доля клеток, подвергшихся двойной инфекции, среди общего числа зараженных клеток становится постоянной, несмотря на концентрацию вводимых вирусов, как будто дважды инфицированные клетки образуются в результате одноударного, а не двух-ударного процесса, чего можно было бы ожидать для клеток, получающих две независимо инфицирующие частицы. Hirst предположил, что двойная инфекция, характеризующаяся одяоударным процессом, 'инфицируется предобразованными смешанными агрегатами. Если агрегат, включающий вирусные частицы с разными недостающими фрагментами РНК, входит в клетку, то благодаря топографической близости таких частиц шансы на успешное начало инфекции должны существенно возрасти. Такой механизм должен повышать шансы на рекомбинацию 'как в опытах по смешанной инфекции, так и в природе. Если образование смешанных агрегатов является универсальным феноменом, частота рекомбинации не должна быть столь значительной, как первоначально предполагалось, поскольку трудно отличить смешанные агрегаты от истинных рекомбинантов. Более того, интенсивная реактивация случайно дефектных вирусных частиц в процессе образования смешанных агрегатов должна бы сделать роль инфекционных вирионов гриппа сомнительной.

Случайная сборка фрагментов РНК могла бы обеспечивать вирусу преимущество благодаря сильно увеличенным шансам на рекомбинацию, но, с другой стороны, это может оказаться невыгодным, так как слишком мала вероятность того, что сгруппируется полный набор фрагментов. Возможным объяснением наблюдаемой частоты рекомбинации является постулированное выше образование дефектными вирусными частицами смешанных агрегатов. Compans и соавт. (1970) предложили также модель, которая постулирует упаковку в 'виряон большего числа фрагментов РНК, чем в основном наборе. Включение избыточных двух или трех фрагментов РНК на частицу существенно увеличивает долю полных частиц.

С другой стороны, Pons (1970) .предположил, что (фрагменты РНК удерживаются друг с другом с помощью белкового тяжа, состоящего из субъединиц РНП, и что вновь синтезированная РНК включается в РНП путем смещения с этого тяжа матричной РНК- Биологическая активность РНП, но не РНК (Hirst, Pons, 1972), и тесная связь РНП с РНК-синтезирующей активностью (Compans, Caliguiri, 1973) указывают на то, что в репликации РНК важная роль принадлежит именно РНП, а не свободной РНК- Эта гипотеза,, однако, должна предусматривать линейное расположение фрагментов генома, для чего, если не считать работу Mackenzie (1970), генетические исследования пока не в состоянии предоставить соответствующих данных.

Б. МНОЖЕСТВЕННАЯ РЕАКТИВАЦИЯ И КРОСС-РЕАКТИВАЦИЯ

И множественная реактивация, и кросс-реактивация являются генетическими рекомбинациями, включающими вирус,, который потерял инфекционность в результате повреждения своей РНК- Множественная реактивация имеет место в случае инактивированного вируса одного и того же генотипа, когда в множественно инфицированной клетке присутствует по меньшей мере один полный набор интактных фрагментов генома. Barry (1961) в опытах по множественной реактивации вирусов гриппа, инактивированных ультрафиолетом, сравнивал экспериментально полученные кривые типа доза — ответ применительно к множественности заражения и выхода вируса с теоретическими кривыми, построенными, согласно-рекомбинационной модели Luria и Dulbecco (1949), «а основании предположения о различном числе радиационно-чув-ствительных единиц. Большее совпадение наблюдалось с кривой, жогда предполагали, что геном состоит из шести ра-диационно-чувствттельных единиц. Соблазнительно приравнять радиационно-чувствительные единицы к фрагментам РНК- Однако, поскольку на выход вируса может воздействовать феномен фон-Магнуса или интерференция, неизбежные-в таких экспериментах, он может неточно отражать число клеток, продуцирующих вирус. Желательно, чтобы множественная реактивация вновь была количественно рассмотрена с применением усовершенствованных методов, таких, как анализ инфекционных центров или иммунофлюоресцентный подсчет инфицированных клеток.

Отсутствие множественной реактивации между неполными вирусами (феномен фон-Магнуса) можно объяснить тем, что-

у них нет общей части генома (Rott, Scholtissek, 1963). Элек-трофоретический анализ РНК выявил отсутствие самого больцгого фрагмента РНК в .препаратах вируса фон-Магнуса (Pons, Hirst, 1969; Choppin, Pons, 1970). Однако, по-видимому, пока еще преждевременно делать вывод о том, что именно этот фрагмент РНК представляет собой утерянную часть1 генома в вирусе фон-Магнуса, поскольку количественная корреляция между исчезновением фрагмента РНК и степенью «неполноты» вируса отсутствует. Профиль РНК остается неизмененным до тех пор, пока отношение БОЕ к единицам тсмагглютинации не упадет до 1:/3о и менее.

Кросс-реактивация — это рекомбинация между инактиви-ро'ванным вирусом и живым вирусом другого генотипа. Это взаимодействие интенсивно используют для выделения реком-бннантов, поскольку оно предлагает удобный путь отбора нужных их типов за счет сильно подавленного выхода инак-тивлрованного родительского вируса (Kilbourne, Murphy, I960), особенно в соединении с 'использованием для подавления живого родительского штамма селектирующих клеток-хозяев. Нет данных о там, что инактивация сама по себе существенно изменяет механизм рекомбинации или увеличивает уровень рекомбинации. Полученные типы рекомбинан-тов являются одинаковыми независимо от того, был ли один из родительских штаммов инактивирован или нет (McCahon, Schild, 1971).

Кросс-реактивацию использовали для установления доли генома, вовлеченной в проявление определенной функции. Путем сравнения уровня инактивации инфекционности с уровнем бляшкообразующей способности Sugiura и Ueda (1971) предположили, что для образования бляшек на клетках FL штамму NWS требуется около 7з генома. Аналогичные опыты, проведенные McCahon и Schild (1971), привели к заключению, что 50% генома вовлечены в функцию бляш-кообразования у FPV на клетках куриного эмбриона. Эти величины, вероятно, завышены с точки зрения возможности того, что образование бляшек является строгим критерием способности IK росту в определенных клетках, как уже обсуждалось в разделе IVB, 1.

В. КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ

Dans le tableau. 23 приведен типичный пример комплементации между ts-мутантами, тогда как в табл. 24 указывается на отсутствие комплементации в случае другой пары мутантов. Мутанты, относящиеся к различным группам, комплементи-руют друг с другом при смешанной инфекции с уровнем комплементации, изменяющимся от 21 до 17 900 (Sugiura et al., 1972). Выход вируса при неразрешающей температуре, появ-

ляющегося в результате комплементации, обычно превышает

10% от выхода вируса при разрешающей температуре. Шля1

некоторых пар, однако, (получен значительно меньший выход

даже при наличии как комплементации, так и рекомбинации,

что, по-видимому, обусловлено взаимной интерференцией му

тантов при неразрешающей температуре. j

Важной характерной особенностью комплементации,. в противоположность рекомбинации, является то, что большая часть потомственного вируса, продуцируемого при неразрешающей температуре, все еще сохраняет исходное ts-свойство (см. табл. 23). Вместе с (Комплементацией при неразрешающей температуре имеет место я рекомбинация, но .когда 1во взаимодействие вовлекаются мутанты, дефектные в ранней стадии репликации вируса, -комплементация является необходимым условием для образования рекомби-нантов.

Комплементацию между штаммами вируса, существующими в природе, интенсивно не исследовали. Выделение неней-ротротгаого штамма Mel из мозга мыши, зараженной смесью штаммов NWS и Mel, могло бы представлять собой пример •комплементации (Fraser, 1959c).

V!. ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ СМЕШЕНИЕ И ГЕТЕРОЗИГОЗИС

Фенотилическое смешение происходит при любой комбинации вирусов гриппа независимо от их генетической совместимости, например между вирусами гриппа А и В (Gotlieb, Hirst, 1954) и даже между вирусами гриппа и парамяксо-вирусом (Granoff, Hirst, 1954). Во всех случаях, в которых было показано фенотипическое смешение, этот феномен наблюдался для НА*, но нет причин сомневаться в возможности фенотнпнчеакого смешения NA*. Лишь небольшое число новых данных или новая их интерпретация были добавлены к тому, что описано в разделе I. Сделаем лишь (Краткие замечания по методическим проблемам, относящимся к фенотипиче-скому смешению. Почти все потомство вируса, производимого' смешанно инфицированной клеткой, является фенотилически смешанным или испытывает двойную нейтрализацию при скрещивании, включающем два антигенно ОТЛИЧНЫХ штамма вируса. Соответственно /использование антисыворотки для целей селекции определенного серотипа убирает основную массу рекомбинантов. Желательно, чтобы добавление анти-сьгворотки было задержано до тех пор, пока все фенотипиче-ски смешанные вирусные частицы не проникнут в «летки при следующем пассаже, 'особенно когда хотят получить интенсивное выделение рекомбинантов или когда рекомбинацию изучают количественно.

Несмотря на важное значение, придававшееся в раннем перио'де исследований по генетике гетерозиготам как источникам! рекомбинантов (Hirst, Gotlieb, 1955) (раздел IA, 2с), убедительные данные об их существовании отсутствуют. Сейчас понятно, что «гетерозиготы», выявлявшиеся в то время, в большинстве случаев были смешанными агрегатами, содержащими вирусные частицы двух различных генотипов. Во-первых, 'большинство гетерозигот было, вероятно, диллоида-ми, так как они являлись 'гетерозиготными по нескольким признакам (Hirst, Gotlieb, 1955). Во-вторых, существенная часть частиц в вирусном препарате находится в виде агрегатов (Hirst, 1973; Hirst, Pons, 1973). Если гетерозигота и существует в виде, не представляющем собой смешанного агрегата, то в настоящее время этого нельзя доказать, так как нет метода, приемлемого для экспериментального разделения двух форм: одной, содержащей два различных внутренних генома, и другой, состоящей из двух внешне раздельных,, но тесно связанных между собой частиц. Либо гетерозиготы,, либо смешанные агрегаты могут быть основным источником рекомбинации при определенных экспериментальных условиях, но они, по-видимому, не ответственны за генерацию ре-комбинантов в обычных смешанных инфекциях, и доля их в смешанном урожае вируса невелика. Исследование отдельных клонов, выделенных из смешанного урожая после заражения вирусами NWS и Гонконг, о котором уже упоминалось в разделе VA, 1 (Tobita, 1971, 1972), показало, что только 3 клона из 194 давали рост двух различных генотипов при следующем пассаже. Поскольку все эти клоны непосредственно исследовали на серотил НА* и NA* методом бляшек без промежуточных пассажей, присутствие вирусов двойственного типа легко могло быть определено.

VII. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ TS-МУТАНТОВ

Условно-летальные мутанты бактериофага были изящно использованы при выяснении биохимических стадий вирусной репликации (Epstein et al., 1963). Аналогичные исследования в отношении вируса гриппа были начаты лишь недавно. Тридцать четыре ts-мутанта вируса WSN, полученные Su-giura и соавт. (1972, 1975), были разбиты на семь неперекрывающихся рекомбинационно-комплементационных групп (I— VII) на основании наличия или отсутствия рекомбинации и комплементации при смешанных парных инфекциях. Мутанты, принадлежащие к группам I, II, III и V, проявляют отсутствие синтеза РНК при неразрешающей температуре а присутствии актиномицина D и наиболее вероятно, что они являются дефектными по ранним функциям, относящимся ли-

бо к транскрипции, либо к репликации РНК. Мутанты /групп IV, VI и VII синтезируют при тех же условиях заметные количества РНК, -превышающие 10% от синтеза в 'Контроле. Они, вероятно, представляют собой мутанты, дефектные по поздним функциям (Sugiura et al., 1975). Два мутанта из группы IV, изученные к настоящему времени, не продуцируют ни функционально-активного НА*, ни NA*, хотя по данным электрофореза все полипелтиды синтезируются и, более того, исследования в электронном микроскопе выявляют отпочкование вирусных частиц яри неразрешающей температуре. Термолабнльность NA* вирионов, выращенных при разрешающей температуре, предполагает, что причины дефектности мутантов этой группы заключены в NA* (Palese et al., 1974). Для мутантов группы VI, с другой стороны, термолабиль-ность их НА* и их способность давать увеличение выхода НО-содержащих 1&+-рекомбинантов при скрещивании с НЗ-со-держащим вирусом предполагают наличие повреждений в НА* (Ueda, Tobita, Sugiura, неопубликованные данные).

Наибольшую трудность для характеристики мутантов представляет крайняя вариабельность от мутанта к мутанту в пределах одной и той же группы таких фенотипических проявлений, .как синтез РНК или полипептидов и продукция РНП, НА* или NA*. Это особенно заметно для мутантов, имеющих повреждения в ранних стадиях репродукции. Обще-принятое объяснение состоит в том, что на фенотипические проявления, как уже указывалось, сильное влияние оказывает текучесть мутантов, и иногда небольшое количество тРНК, синтезируемых благодаря такой текучести, обеспечивает почти нормальное проявление определенных физиологических функций. Сделанные ранние заключения основаны, следовательно, на характеристике таких мутантов из каждой группы, которые имеют наименьшую, где это возможно, текучесть.

Четырнадцать ts-мутантов ВЧП, выделенных Ю. 3. Гендо-ном и соавт. (1973в), были разбиты .на четыре рекомбина-ционные или на пять комплементационных групп. Рекомбинация между комплементационными группами А и В отсутствовала. КомплементаЦ'шнная группа D является, вероятно, дефектной в ранней стадии репликации вируса. Один мутант из этой группы был РНК" 'в присутствии актиномицина D и не синтезировал сколько-нибудь заметных количеств продуктов деятельности генов. Его вирион-ассоциированная транскриптаза была значительно менее активной при неразрешающей температуре, чем при разрешающей. Мутант из группы Е обладал противоположными свойствами, т. е. был способен синтезировать РНК, а также полипептиды, включая функционально-активные НА и NA, а также РНП в количествах, 'Сравнимых с таковыми в диком типе. ts-My-танты WSN, выделенные Mackenzie (1970), а также Mackenzie и Dimmock (1973), распределяются в пяти или, возможно, шести группах, когда их наименее охарактеризованные мутанты ts-З и ts-8 рассматриваются входящими каждый в отдельную группу.

Около 80 ts-мутантов WSN, изученных группой под руководством Hirst (Simpson, Hirst, 1968; Hirst, Pons, 1972; Hirst, 1973), были распределены в восьми комплементационно-рекомбннационных группах.

Таким образом, число выявленных групп все более приближается к предполагаемому числу генов. Детальная характеристика этих мутантов должна выявить неизвестные пока функции каждого гена и (комплексные взаимодействия их продуктов. Тогда генетика вируса гриппа, несомненно, будет обсуждаться с совершенно иной точки зрения.

Кроме использования для целей генетического анализа, ts-мутаяты могут служить кандидатами в аттенунрованные живые вирусные вакцины вследствие их значительно сниженной патогенности как для животных, так и для человека (Mackenzie, 1969; Mills, Chanock, 1971; Murphy et al., 1972; Ghendon et al., 1973a). Мутант, о котором известно, что он несет :мутацяю в части генома, отличной от той, которая кодирует НА* или NA*, мог бы быть полезным в качестве потенциального донора температурной чувствительности для любого будущего эпидемического штамма.

Viii. CONCLUSION

В настоящее время большинство экспериментальных данных совместимо с положением о том, что геном состоит из субгеномных фрагментов, транскрипты которых функционируют как моноцистронные информационные РНК, и что эти фрагменты в процессе сборки вновь группируются для образования зрелого вириона. Но точный механизм оборки еще должен быть выяснен, чтобы определить, является ли такая группировка случайным процессом или при этом действует механизм, обеспечивающий эффективное созревание. К другим, плохо пока понятным, явлениям следует, по-видимому, отнести генетически контролируемое, плавно меняющееся выражение нейраминидазного гена, как это наблюдается для рекомбинанта Х7 в сравнении с Х7 (F1), и многие другие вопросы.
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Генетика вируса гриппа

  1. Annexe 4 Grippe causée par le virus de la grippe A (H5N1) (grippe aviaire)
    La grippe aviaire est une infection virale hautement contagieuse qui peut toucher toutes les espèces d'oiseaux. Parmi les espèces domestiques, les dindes et les poulets sont les plus sensibles. Les oiseaux sauvages peuvent transmettre l'infection. Le réservoir naturel des virus de l'influenza aviaire (AIV) est la sauvagine, qui est le plus souvent responsable de l'introduction de l'infection dans les ménages. L'étiologie. AHP appartient à
  2. La culture des virus de la grippe humaine en laboratoire, le cercle d'hôtes parmi les animaux de laboratoire et l'isolement du virus du matériel clinique
    B.R.DAUDLE et G.S. SCHILD aux virus de la grippe (Schafer, 1955). En 1931, Shope passa la grippe porcine «classique» en administrant par voie intranasale un filtrat de sécrétions respiratoires. Premières données sur
  3. Kilburn ED. Virus grippaux et grippe (1978), 1978
    Le livre est consacré à une revue d'une variété de virus grippaux, leur culture, leur biochimie et leurs caractéristiques moléculaires. Contenu: Grippe et virus grippaux. La structure du virus de la grippe. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase. Activité de transcriptase dans les cellules et les virions de la grippe. Virus Ribonucleic Acids
  4. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions
    RV OIMPSON et VD BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. INTRODUCTION Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, et donc la plupart des informations sont fragmentées dans sa composition de si un grand nombre de problèmes non résolus. La principale déclaration sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus génomiques négatifs.
  5. Sujet: Génétique des virus
    L'importance de la virologie dans le développement de la génétique. Organisation de l'appareil génétique des virus. Différences dans les génomes des virus à ARN et à ADN. Variabilité de la modification des virus: mélange phénotypique, polyploïdie. Types de variation génétique des virus: mutacine, recombinaison, erreurs de copie des génomes. Mutations dans les virus et leur classification. Mutations spontanées et induites,
  6. Virus de la grippe et grippe
    E. D. KILBOURNE I. INTRODUCTION. INFLUENZA - UNE MALADIE AUX SYMPTOMATIQUES INCHANGEABLES, CAUSÉE PAR UN VIRUS CHANGEABLE L'énorme intérêt suscité par la virologie moderne pour la grippe et les virus responsables de son apparition nécessite une explication, étant donné la nature ordinaire des symptômes de cette infection respiratoire, généralement très légère,
  7. Structure du virus de la grippe
    P.V. SHOPPIN ET R.V. KOMPANS (PW CHOPPIN, J. W. COMPANS) I. INTRODUCTION L'étude du virus de la grippe est depuis longtemps «à la pointe des études structurales en virologie. Le virus de la grippe a été l'un des premiers à être étudié: en utilisant la microscopie électronique (Taylor et al., 1943), et lors de l'utilisation de cet objet particulier comme modèle, il a été «constaté que certains virus
  8. Réplication du virus de la grippe
    K. SHOLTISSEK et H.-D. KLENK (SN. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. INTRODUCTION Il existe un certain nombre d'études sur le problème de la réplication du virus de la grippe. La littérature jusqu'en 1968 est résumée dans des articles de Hoyle (1968) 'et Scholtissek (1969); les travaux ultérieurs sont des revues de White (1973), ainsi que Compans et Choppin (1974). La plupart des données sur la réplication obtenues dans l'étude du virus de la grippe de type A. Essentiel
  9. Variabilité antigénique du virus de la grippe
    RG WEBSTER et WG LEIVER i (RG WEBSTER et WG LAYER) I. INTRODUCTION Le virus de la grippe de type A1 est unique parmi les agents pathogènes des maladies infectieuses humaines en raison de sa capacité à modifier sa propre structure antigénique au point que l'immunité spécifique acquise la réponse "et l'infection par une souche est très faible ou ne protège pas contre la suivante
  10. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  11. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine
    I. T. SCHULZE (I. T. SCHULZE) I. INTRODUCTION Le fait que les virus de la grippe ont la capacité d'agglutiner les globules rouges a joué un rôle important dans le développement de nos idées sur ces particules infectieuses. L'hémagglutination s'est révélée être une méthode extrêmement pratique pour identifier, purifier et déterminer la concentration de virus. De plus, depuis (le moment de la découverte du phénomène d'hémagglutinacip il y a 35 ans
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com