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Environnements de cuisson

Les plats pour la préparation des supports ne doivent pas contenir de substances étrangères, telles que des alcalis, émises par certaines qualités de verre ou des oxydes de fer, qui peuvent pénétrer dans le milieu lors de la cuisson dans des pots rouillés. Il est préférable d'utiliser des ustensiles en verre, émaillés ou en aluminium. De grandes quantités de milieu (des dizaines et des centaines de litres) sont préparées dans des digesteurs ou réacteurs spéciaux. Avant utilisation, la vaisselle doit être soigneusement lavée, rincée et séchée. La nouvelle verrerie est préchauffée pendant 30 min dans une solution à 1 à 2% d'acide chlorhydrique ou immergée dans cette solution pendant une nuit, après quoi elle est rincée à l'eau courante pendant une heure. (Les plats destinés à la préparation de milieux ne doivent pas être utilisés à d'autres fins, par exemple pour le stockage de produits chimiques ou de solutions désinfectantes - même des traces de ces substances peuvent provoquer la croissance de micro-organismes.)

Les matières premières pour la préparation de la plupart des environnements sont des produits d'origine animale ou végétale: viande et ses succédanés, lait, œufs, pommes de terre, soja, maïs, levure, etc.

Les principaux bouillons nutritifs sont préparés sur de l'eau de viande ou sur différents digestats obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de la matière première. Les bouillons des digestats sont 5 à 10 fois plus économiques que ceux de l'eau de viande. Le milieu de digestion est plus riche en acides aminés, donc plus nutritif; ont un tampon plus important, c'est-à-dire ont une valeur de pH plus stable. De plus, les médicaments peuvent être préparés à partir de substituts de viande (caillots sanguins, placenta, caséine, etc.).

Actuellement, l'approvisionnement des laboratoires en eau de viande et pauses est centralisé. Le plus souvent, ils utilisent le digestif pancréatique de Hottinger, des hydrolysats de caséine ou de levure fourragère. Selon certaines recettes, les supports nécessaires sont préparés à partir de ces produits semi-finis.

Étapes de préparation du support: 1) cuisson; 2) établir le pH optimal; 3) clarification; 4) filtration; 5) déversement; 6) stérilisation; 7) contrôle.

Faire cuire le milieu sur un feu ouvert, un bain-marie, dans un autoclave ou des chaudières chauffées à la vapeur.

L'établissement du pH du milieu est réalisé approximativement à l'aide de papiers indicateurs. Un potentiomètre est utilisé pour déterminer avec précision le pH.

Le milieu est versé dans des tubes à essai (3-5 ml ou 10 ml chacun), des flacons, des flacons, des matrices et des flacons dans un maximum de 23 conteneurs, car pendant la stérilisation, les tubes peuvent être mouillés et les milieux perdront leur stérilité.

Les milieux stérilisés à des températures supérieures à 100 ° C sont versés dans des plats propres et secs. Les milieux stérilisés à une température inférieure doivent être versés dans des plats stériles.

Le milieu est versé à l'aide d'un entonnoir, au bout duquel * un tube en caoutchouc avec une pince Mora est mis. Pour les déversements volumétriques, des béchers, des burettes, des pipettes, des seringues, des pipettes, etc. sont utilisés.

Les plats avec le médium sont généralement recouverts de bouchons de gaze de coton, au-dessus desquels des bouchons en papier sont mis. Il est important que pendant le déversement, le milieu ne mouille pas les bords de la vaisselle, sinon des bouchons pourraient s'y coller. Une étiquette avec le nom du milieu et sa préparation doit être apposée sur chaque récipient.

Stérilisation. Le mode de stérilisation dépend de la composition du milieu et est indiqué dans sa recette. Un schéma approximatif du mode | Le support est indiqué dans le tableau.

Mode de stérilisation

Mode de stérilisation | C

Appareil

Pression de température

Simple

Autoclave

120 ° C (1 atm)

20 min

Complexe: 1) avec glucides, lait, gélatine

Autoclavage à capuchon fermé ou appareil Koch

100 ° C (vapeur qui coule)

30-60 minutes 3 jours consécutifs (stérilisation fractionnée)

2) protéine (lactosérum ou œuf) avec un phoque

Coagulateur Koch (deux modes sont possibles)

80-85 ° C

1 h 3 jours d'affilée

1 h une fois |

3) protéine, liquide

Bain-marie ou inactivateur

1 h 3 à 4 jours consécutifs W

Contrôle des milieux prêts à l'emploi: a) pour contrôler la stérilité du milieu, mettre dans un thermostat pendant 2 jours, après quoi ils sont visualisés. S'il n'y a aucun signe de croissance sur les milieux, ils sont considérés comme stériles et plusieurs échantillons de chaque série sont transférés pour contrôle chimique ps; b) contrôle chimique: établir enfin le pH, la teneur en azote total et aminé, la peptone, les chlorures (ou la quantité doit correspondre à celle spécifiée dans la recette).

Le contrôle chimique des milieux est effectué dans un laboratoire de chimie; c) pour le contrôle biologique, plusieurs échantillons du milieu sont inoculés avec des cultures spécialement sélectionnées de micro-organismes, et leur croissance est utilisée pour juger des propriétés nutritionnelles (croissance) du milieu. Une étiquette et un passeport sont attachés au support fini, qui indiquent le nom et la composition du support, les résultats du contrôle, etc.

Stockez les médias à température ambiante dans des armoires, de préférence spécialement conçues pour eux. Certains milieux, comme ceux contenant du sang et des vitamines, sont conservés au réfrigérateur.

Recettes pour la préparation de milieux simples (basiques) et de solution de chlorure de sodium isotonique

Solution de chlorure de sodium isotonique. A 1 litre d'eau distillée, 9 g de chlorure de sodium sont ajoutés.
La solution est filtrée, le pH souhaité est ajusté et, si nécessaire, stérilisé à 120 ° C pendant 30 minutes.

Bouillon de peptone de viande (BCH). À l'eau de viande, ajoutez 1% de peptone et 0,5% de x. y compris le chlorure de sodium, faire bouillir à feu doux pendant 10 à 15 minutes pour dissoudre les substances, régler le pH souhaité et faire bouillir à nouveau pendant 30 à 40 minutes jusqu'à ce qu'un précipité se forme. Filtrer, ajouter au volume d'origine avec de l'eau et stériliser 20 min à 120 ° C.

Bouillon Hottinger. Le breuvage Hottinger est dilué 5-6 fois avec de l'eau, selon la quantité d'azote aminé qu'il contient et la quantité qu'il devrait contenir dans le bouillon (indiqué dans le passeport et la recette du milieu). Par exemple, pour préparer un milieu avec 1,2 hl d'azote aminé, un digest contenant 9,0 hl doit être dilué 7,5 fois (9,0: 1,2). Du chlorure de sodium à 0,5% est ajouté au digesté dilué et bouilli à feu doux jusqu'à dissolution du sel. Dans le milieu refroidi, le pH est ajusté, filtré, versé et stérilisé pendant 20 minutes à 120 ° C.

Gélose à la peptone de viande (MPA). Au bouillon fini (avant ou après stérilisation), ajouter 2-3% d'agar-agar écrasé et faire bouillir, en remuant, à feu doux jusqu'à; fusion complète de l'agar. Le MPA peut être cuit dans un autoclave ou un appareil Koch. Le milieu préparé, si nécessaire, est clarifié, filtré et stérilisé pendant 20 minutes à 120 ° C. L'agar semi-liquide contient de 0,4 à 0,5% d'agar-agar.

Gélatine nutritive. De la gélatine à 10-15% est ajoutée au bouillon fini, chauffée jusqu'à ce qu'elle fonde (ne pas bouillir!), Versée dans des plats stériles et stérilisée à la vapeur fluide.

Recettes pour la préparation d'environnements complexes Environnements glucidiques. Au bouillon principal ou à la gélose fondue, ajoutez la bonne quantité (0,1-2%) d'un certain glucide (par exemple, le glucose). Après sa dissolution, il est versé dans des boîtes stériles et stérilisé] à la vapeur d'eau. Étant donné que les glucides sont partiellement détruits même avec ce schéma de stérilisation, il est préférable d'ajouter une solution de 25 à 30% de glucides stérilisés à travers un filtre bactérien dans le volume requis, en observant | aseptiques aux environnements de base stériles. Après contrôle de la stérilité, le milieu est prêt à l'emploi.

Le milieu sanguin est préparé à partir de milieux simples stériles, en ajoutant des conditions aseptiques (de préférence en boxe) de 3 jours à 30% (généralement 5%) de sang stérile défibriné. Les milieux gélosés sont ensuite fondus et refroidis à une température de 45 ° C. À la bonne température, il devrait y avoir une sensation de chaleur tolérante, mais pas de brûlure. Après avoir ajouté du sang, jusqu'à ce que le milieu ait gelé, le contenu du récipient est soigneusement mélangé * et versé dans des tasses ou des tubes à essai.

Attention! Le milieu contenant du sang ne peut pas être fondu - le sang est mesuré | nit ses propriétés. Les milieux sériques sont préparés de la même manière que les milieux sanguins. Aux milieux de base, ajouter 10 à 20% de sérum qui ne contient pas de conservateur et préalablement inactivé à 56 ° C pendant 30 minutes au bain-marie ou: inactivateur. Pendant l'inactivation, la substance (complément) est détruite, ce qui a un effet néfaste sur les microbes.

Mercredi avec bile. Aux milieux simples, de la bile est ajoutée à raison de 10 à 40% du volume du milieu, le pH souhaité est fixé et stérilisé 20 minutes à 120 ° C. Vous pouvez ajouter de la bile stérile à un environnement stérile dans des conditions aseptiques.

Renverser le milieu gélose dans des boîtes de Pétri. Les milieux sont fondus dans un bain d'eau avant le déversement et refroidis à 45-50 ° C. Habituellement, pour une tasse d'un diamètre de 9 cm, 15-20 ml de milieu sont suffisants (hauteur de couche 0,25-0,3 cm). Si la couche est plus haute, les colonies semblent moins contrastées. Avec une couche très mince, la quantité de nutriments et d'humidité est fortement limitée (le milieu sèche rapidement) - les conditions de culture s'aggravent.

Le milieu est versé dans des boîtes stériles dans des conditions aseptiques. Les tasses sont fixées avec le couvercle vers le haut. Le récipient avec le médium est pris dans la main droite, le tenant par le feu. Retirez le bouchon de la main gauche en le tenant avec l'auriculaire et la paume. Ils brûlent le col du vaisseau et ouvrent légèrement le couvercle avec deux doigts de la main gauche. Insérez le goulot de la bouteille en dessous sans les toucher au bord de la tasse. Lorsque vous versez le milieu, assurez-vous qu'il est uniformément réparti le long du fond de la tasse. Si des bulles d'air se forment pendant le déversement à la surface du milieu, elles leur apportent la flamme d'allumette ou les brûleurs avant que le milieu ne durcisse, les bulles éclatent. Ensuite, la tasse est fermée et le milieu peut se solidifier. Si le semis est effectué le jour du déversement, le milieu doit être séché. Pour ce faire, ouvrez soigneusement les tasses dans le thermostat et placez les couvercles et les tasses côté ouvert pendant 20 à 30 minutes. Si le semis est effectué le lendemain du déversement, les gobelets, sans séchage, sont enveloppés dans le même papier dans lequel ils ont été stérilisés, et placés au réfrigérateur.

Préparation d'agar fauché. Les tubes contenant 4 à 5 ml de milieu de gélose fondu stérile sont placés dans une position inclinée (approximativement à un angle de 20 °) afin que le milieu ne dépasse pas 23 tubes, sinon il pourrait mouiller le tube. Une fois le milieu durci, les tubes sont placés verticalement - ils permettent au condensat de s'écouler. Il vaut mieux manger de la gélose fraîchement coupée.

Attention! N'utilisez pas un milieu dans lequel il n'y a pas de condensation. Il doit être refondu au bain-marie et tondu.
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Environnements de cuisson

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