Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

Réplication du virus de la grippe

K. SHOLTISSEK et H.-D. KLENK (SN. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK)



I. INTRODUCTION

Il existe un certain nombre d'examens sur la question de la réplication du virus de la grippe. La littérature jusqu'en 1968 est résumée dans des articles de Hoyle (1968) 'et Scholtissek (1969); les travaux ultérieurs sont des revues de White (1973), ainsi que Compans et Choppin (1974).

La plupart des données sur la réplication ont été obtenues dans l'étude du virus de la grippe de type A. Il n'y a pas de différences significatives dans les mécanismes de réplication d'autres types de virus de la grippe.

Plusieurs systèmes de cultures cellulaires propices à l'étude de la réplication se sont généralisés, par exemple, la propagation de la souche WSN du virus de la grippe dans les cellules MDBK (Choppin, 1969) ou la propagation du virus de la peste aviaire (FPV) dans les cellules fibroblastiques d'embryons de poulet. Un exemple de la courbe de croissance du dernier virus en un seul cycle est prouvé à 30 ans, où la période de latence est d'environ 3 heures et la production de virus atteint un plateau entre 8 et 12 heures. En général, dans de tels systèmes cellulaires, un rendement élevé du virus infectieux est observé et la synthèse des protéines cellulaires est très efficacement supprimée après infections. Par conséquent, ces systèmes sont très pratiques pour les études biochimiques.

II. ADSORPTION, PÉNÉTRATION, SOUS-MARINE DU VIRUS

L'infection d'une cellule par un virus commence par l'adsorption, c'est-à-dire la fixation d'une particule virale à la surface cellulaire. Deux structures complémentaires sont nécessaires pour l'attachement, à savoir: les sites récepteurs à la surface cellulaire et le composant viral responsable de la reconnaissance de ces sites récepteurs. Depuis de nombreuses années, la capacité du virus de la grippe à interagir avec des globules rouges d'origines diverses et à les agglutiner est connue (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941). L'hémagglutination a été utilisée comme modèle de réaction de l'interaction du virus de la grippe avec la surface de la cellule, et «la plupart de vos connaissances sur ce phénomène proviennent de ces études. Cependant, il faut être très prudent dans les généralisations, car les structures des surfaces érythrocytaires et des surfaces des cellules infectées peuvent être complètement différentes (voir également le chapitre 3).

A. RÔLE DE L'HÉMAGGLUTININE DANS L'ADSORPTION

Le composant du virion impliqué dans la liaison est "l'épine" de HA *. Le rôle des protéines virales dans l'initiation de l'infection a été étudié à l'aide d'anticorps spécifiques à deux protéines de surface: HA * et NA *. Ces anticorps peuvent être obtenus en utilisant des virus recombinants. Par exemple, le croisement entre les virus AO et A2 conduit à la formation du X7F1 recombinant, qui porte HA *, AO et NA * A2 (Kilbourne et al., 1968). L'antisérum X7F1 n'inhibe pas la NA * des virus de la grippe de type AO, mais inhibe l'hémagglutination et neutralise l'infectiosité de ce type de virus. L'interaction du même sérum avec les virus de la grippe de type A2 n'inhibe pas l'hémagglutination ni l'infectiosité, bien que la neutralisation de l'activité de NA * soit complète. Ainsi, NA * n'est pas inclus dans l'initiation de l'infection, et seul HA * est apparemment responsable de l'adsorption. Ce concept est étayé par des preuves que les particules virales dont seuls les pics de neuraminidase ont été retirés par les enzymes protéolytiques restent infectieuses (Schulze, 1970). Il est prouvé que la partie hémagglutinante est localisée sur la partie externe de "l'épine" de HA *, riche en glucides (voir chapitre 3). Les glucides sont apparemment nécessaires au fonctionnement de HA *, car les protéines HA * non glycosylées sont incapables de se lier aux globules rouges (Klenk et al., 1972b).

RÉCEPTEUR DU VIRUS D'INFLUENZA

Les glucides sont essentiels (non seulement l'hémagglutishine, mais aussi le récepteur viral à la surface des cellules. Hirst (1942) a observé que le complexe virus - érythrocytes est instable et que le récepteur à la surface de la cellule est détruit par l'enzyme virale. Comme montré plus loin, cette enzyme est la neuraminidase qui fend l'acide neurochish des glycoprotéines (Klenk et al., 1955; Klenk, Stoffel, 1956; Gottschalk, 1957). Ce fut la première démonstration d'une enzyme qui fait partie d'une particule virale. Les neuraminidases bactériennes sont également capables de décomposer p récepteurs du virus de la grippe (Burnet, Stone, 1947) Ainsi, il a été constaté que le récepteur du virus de la grippe est une glycoprotéine contenant de l'acide neuramique.

Depuis lors, une grande quantité d'informations a été accumulée.

sur le récepteur des myxovirus, résumée récemment dans une revue

Hughes (1973). Les données brièvement obtenues sont réduites à

soufflant. Les sites récepteurs contiennent les restes de neurones-

acide, présent dans les chaînes glucidiques

glycoprotéines. Résidus terminaux non oxydants des névromes

Nousl sont nécessaires pour l'interaction des glycoprotéines avec vi

grippe brun clair. Le traitement à la neuraminidase élimine complètement

activité de liaison. Études de dégradation utilisant

en utilisant le périodate suggèrent que pour la liaison

l'activité nécessite une molécule de neuramine intacte

acides (Suttajit, Winzler, 1971). Groupe carboxyle

joue probablement aussi un rôle important, si nécessaire,

forces apparemment électrostatiques (Huang, 1974).

Il semble probable qu'il n'y ait qu'une faible spécification

personnalité par rapport à la structure avec laquelle il se lie

l'acide neuraminique, car il s'est avéré être entier

un ensemble de glycoprotéines contenant de l'acide yeiraminique,

se lie aux myxovirus. De plus, les gangliosides (gly-

colipides contenant de l'acide neuraminique) est également

sont actifs à cet égard (Haywood, 1975).

Il est à espérer que le problème de la liaison au virus de la grippe deviendra plus clair dans une plus large mesure après que la structure moléculaire du récepteur sera établie. Dans une certaine mesure, cela a déjà été réalisé dans le cas des globules rouges (Marchesi et al., 1973). Des informations supplémentaires peuvent également être fournies par l'étude de l'attachement des mixovirus aux membranes artificielles (Tiffany, Blough, 1971).

B. MÉCANISMES POSSIBLES DE PÉNÉTRATION ET DE «MISE EN ŒUVRE»

Deux mécanismes différents ont été proposés pour la pénétration et la «déshabillage» non seulement du virus de la grippe, mais aussi des virus qui ont une enveloppe extérieure. Les deux points de vue sont basés principalement sur la recherche dans un microcope électronique. L'un de ces mécanismes est le vironexis, qui est considéré comme un processus de pneumocytose, lorsque des particules virales sont incorporées dans les pinosomes, puis fusionnent avec des lysosomes, et que les enzymes des lysosomes provoquent le "dépouillement" du virus (Fazekas de St. Grot, 1948). Des confirmations microscopiques électroniques de ce point de vue ont été obtenues par Dales et Choppin (1962), ainsi que Dourmashkin et Tyrrell (1970). 10 minutes après l'infection, des particules virales en contact direct avec la surface cellulaire étaient visibles et, à la 20e minute, des particules ont été trouvées à l'intérieur des vacuoles cytoplasmiques. Contrairement à cette étude, Morgan et Rose (1968) suggèrent que la pénétration peut résulter de la fusion de l'enveloppe du virus avec la membrane de la cellule hôte. Ainsi, il n'y a actuellement aucun consensus sur le mécanisme de pénétration du virus de la grippe.

Comme décrit au chap. 5, les virions du virus de la grippe contiennent une ARN polymérase associée à leurs composants ribonucléoprotéiques. Il est donc peu probable que le processus de «déshabillage» soit spatialement déconnecté de la libération de ribonucléolotéine. Et cette étape se produit à la surface de la cellule, selon le mécanisme de fusion des membranes, et dans les vésicules phagocytaires, selon le mécanisme de la viroiexis.

III. TRANSCRIPTION A. SÉQUENCE DE SYNTHÈSE D'ARN

Après «déshabillage», l'ARN virion doit être transcrit en ARN complémentaire L'ARN polymérase introduite avec la particule infectieuse doit fonctionner au premier stade de la reproduction du virus (voir Ch. 5). Le génome du virus de la grippe ne peut être isolé des virions que sous la forme

fragments individuels (voir chap. 6). De plus, il fonctionne comme des fragments uniques, comme l'ont montré l'analyse génétique (om. Ch. 7) et l'inactivation progressive d'un virus infectieux (Scholtissek, Rott, 1964). À cet égard, il faut supposer que la polymérase initie la synthèse d'ARN dans chaque fragment individuel. Étant donné que l'ARN n'existe pas dans la cellule en tant que molécule libre, mais est toujours habillé de protéines, la question se pose: à quelle protéine l'ARN viral se lie-t-il lors de sa réplication?

Les expériences menées dans trois études sur la synthèse d'ARN pour le virus de la grippe présentent de grandes difficultés, car l'actinomycine D ne peut pas être utilisée pour détecter la production d'ARN viral avec une suppression spécifique de la synthèse de l'ARN cellulaire, car cet antibiotique inhibe la reproduction du virus de la grippe (Barry et al., 1962 ; Rott, Scholtissek, 1964; Barry et al., 1965; Pons, 1967). Pour cette raison, pour déterminer la séquence de la synthèse d'ARN au fil du temps, une hybridation spécifique d'ARN marqué par impulsions a été utilisée à divers moments après l'infection avec un excès d'ARNv non marqué ou d'ARNc suivi d'un traitement avec l'ARNase (Scholtissek, Rott, 1970). Au cours des premiers stades du cycle infectieux, la synthèse d'ARNc a prévalu, atteignant un maximum d'environ la deuxième heure après l'infection, tandis qu'aux stades ultérieurs, la plupart de l'ARN spécifique au virus produit était de l'ARNv. Krug (1972), en utilisant une autre méthode, a également montré que 4 heures après l'infection, la synthèse de BIKPHK est presque complètement arrêtée. Après extraction au phénol, une quantité relativement faible de dsrnA est détectée (Scholtissek, Rott, 1970).

En raison du fait que l'un ou l'autre type d'ARN viral a des informations1 !! fonctionne et est utilisé comme matrice pour la synthèse des protéines virales (voir section IVA), un certain contrôle traductionnel peut avoir lieu au niveau du catabolisme différentiel de l'ARN viral. Par conséquent, des expériences de poursuite d'impulsion ont été menées pour étudier la stabilité de l'ARN du virus de la grippe in vivo. Il a été établi que, contrairement à l'ARN cellulaire, les deux types d'ARN viral sont complètement stables pendant la période de 90 ans de Chenza (Scholtissek et al., 1972).

Auparavant, lors de l'étude de la synthèse d'ARN viral in vivo, lorsque l'actinomycine D était ajoutée aux derniers stades du cycle d'infection (Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ma-hy, 1970), il n'était pas tenu compte du fait que l'antibiotique inhibe spécifiquement la synthèse d'ARN complémentaire in vivo (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Étant donné que l'ARNdn est isolé des cellules infectées sous la forme d'au moins cinq fragments séparés, il a été conclu que l'ARN viral est également synthétisé sous forme de fragments (Pons et Hirst, 1968).

B. LOCALISATION DE LA SYNTHÈSE DE L'ARN VIRAL À L'INTÉRIEUR DE LA CELLULE HÔTE

À partir des données obtenues par radioautographie, il a été conclu que le noyau de l'ARN viral semble être le noyau des cellules (Scholtissek et al., 1962; Barry et al., 1974). Étant donné que les périodes d'impulsion utilisées dans ces études étaient encore trop importantes, il ne peut être exclu que l'ARN viral soit synthétisé dans le cytoplasme de la cellule puis transporté vers le noyau, où il peut s'accumuler. De plus, les vRNA et ccRNA peuvent être synthétisés dans les cellules à divers endroits.

B. INHIBITION DE LA SYNTHÈSE DE L'ARN VIRAL 1. Actimomycine D, mitramycine et a-amanitine

Lorsque l'actinomycine D ou la mitramycine, qui interfère avec la fonction matricielle de l'ADN, est ajoutée aux cellules infectées lorsqu'une ARN iolymérase dépendante de l'ARN viral y est déjà présente (par exemple, 2 heures après l'infection), l'ARNv continue d'être synthétisé pendant encore environ 2 heures. Cependant, la production d'ARNc est immédiatement interrompue. Plus tard, la synthèse d'ARNv diminue également, indiquant qu'elle nécessite la formation continue de cfRNA (Rott et al., 1965; Scholtissek, Rott, 1970; Scholtissek et al., 1970; Pons, 1973). Gregoriades (1970) a montré que l'actinomycine D exerce également une forte influence sur la synthèse d'ARNv lorsqu'elle est ajoutée aux derniers stades du cycle d'infection. Dans ces expériences, la synthèse d'ARN viral a été déterminée en augmentant l'incorporation d'uridine marquée dans l'ARN total des cellules infectées. Une telle augmentation peut être éliminée par l'ajout d'actinomycine D. Cependant, il convient de garder à l'esprit que l'infection par le virus de la grippe provoque une augmentation de l'incorporation d'uridine marquée dans la cellule après l'infection (Scholtissek et al., 1967) et que l'actinomycine D a un effet inhibiteur sur cette inclusion (Scholtissek et al ., 1969). la siAmanitin, qui n'a pas d'affinité pour l'ADN, affecte l'activité de l'une des ARN polymérases cellulaires (ARN submérase II), et inhibe également la synthèse de l'ARNcc lors de l'ajout au liquide de culture immédiatement après l'infection (Rott, Scholtissek, 1970; Mahy et al., 1972).

Le mécanisme de l'inhibition spécifique de la synthèse de cfRNA par ces antibiotiques n'est pas entièrement compris, car ils n'affectent pas la formation de cfRNA in vitro. Ainsi, ces antibiotiques agissent uniquement in vivo, bien que l'enzyme synthétisant l'ARNcf puisse être isolée des cellules auxquelles l'actinomycine D a été ajoutée 2 heures après l'infection (Scholtissek et Rott, 1969a).

La propagation des virus de la grippe peut également être supprimée par d'autres effets sur l'ADN de la cellule hôte - introduction de mitomtsine C, prétraitement par rayonnement ultraviolet ou élimination des noyaux de la cellule avant l'infection (Barry, 1964; Rott et al., 1965; Nayak, Rasmussen, 1966; Fol- .lett et al., 1974; Kelly et al., 1974). Le mécanisme par lequel ces influences influencent la propagation du virus de la grippe peut être le même que le mécanisme d'action d'autres antibiotiques. La seule hypothèse qui peut être faite sur la base de ces études est qu'il existe un besoin de noyaux cellulaires "fonctionnellement" actifs et (ou) d'une fonction cellulaire dépendante de l'ADN pour la multiplication des virus de la grippe. Il est impossible de dire quelles sont ces fonctions.

2. Cycloheximide

Lorsque du cycloheximide, qui inhibe spécifiquement la synthèse des protéines dans les cellules animales, est ajouté, 2 heures après l'infection par le virus de la grippe, la formation d'ARNv cesse immédiatement, puis 1 car la formation d'ARNvz continue toujours pendant au moins 2 heures (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). On ne sait pas encore si la synthèse continue de la protéine virale 'ou' Cellulaire 'utilisée dans la' Qualité / cofacteur pour la polymérase synthétisant l'ARNv est nécessaire, ou si une 'protéine (par exemple la protéine NP) est nécessaire pour stabiliser l'ARNv nouvellement synthétisé, ou pour supprimer la synthèse d'un virus viral spécifique La protéine conduit à la formation continue d'ARNc, dont la synthèse s'éteint normalement 3 heures après l'infection. Cet arrêt peut être nécessaire pour initier la synthèse d'ARNv. Des études avec des mutants sensoriels de la température devraient répondre à certaines de ces questions.

Les expériences de Bean et Simpson (1973) ont montré que la transcription primaire in vivo (synthèse d'ARNc sur la matrice d'ARNs en utilisant la polymérase de la particule infectante) n'est pas inhibée par le cycloheximide, alors que l'actinomycine D inhibe complètement la transcription. Ainsi, le cycloheximide n'affecte pas in vivo l'activité de la polymérase introduite avec la particule infectieuse et synthétisant l'ARNc cc Il inhibe cependant la synthèse d'une nouvelle polymérase nécessaire à la production d'ARNc.

3. Glucosamine

La glucosamine est connue pour épuiser le pool d'UTP dans les cellules d'un embryon de poulet par la formation d'UTP-] M-acétylglycosamine (Scholtissek, 1971). Lorsque la solution d'Earl contenant du glucose est utilisée comme milieu de culture, elle

affecte uniquement la synthèse des glncoprotéines virales (voir section V). Si, cependant, le glucose comme source d'énergie est remplacé par du liruvate ou du fucose, alors l'épuisement du pool UTP par ces sucres aminés se produit environ 10 fois plus activement. Dans ces conditions, le pool UTP de la cellule hôte devient un limiteur spécifique de l'acuité de la synthèse d'ARNv, tandis que la synthèse (d'ARN cellulaire n'est pas encore affectée (Scholtissek, 1975). Du fait de la suppression de la synthèse d'ARN viral, la formation de protéines virales est également absente.

Ces données peuvent être interprétées de deux manières: soit une ARN polymérase dépendante de l'ARN viral a une faible affinité pour l'UTP par rapport aux polymérases RIC cellulaires dépendantes de l'ADN, soit il existe deux pools UTP plus ou moins indépendants dans la cellule, dont l'un peut Il peut être utilisé pour la synthèse d'ARN viral et subit un effet plus important de la part de la glucosamine qu'un autre pool, qui peut être utilisé comme substrat pour les ARN polymérases testiculaires.

D. SYNTHÈSE DE L'ARN VIRAL IN VITRO

Plusieurs chercheurs ont découvert l'ARN polymérase dépendant de l'ARN dans des cellules infectées par le virus de la grippe (Ho, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans, Cali-guiri, 1973). La majeure partie de l'activité enzymatique se trouve dans la fraction microsomale des cellules infectées. Dans un système in vitro, cette activité est supprimée par l'ARNase, mais pas par l'ADNase. Cela signifie que l'ARN est la matrice interne.La réaction nécessite la présence des quatre nucléosides triphosphates et est sensible à l'actine-icine D. La plupart des produits de réaction in vitro ont un faible poids moléculaire relatif. Les données de Horisberger et Guskey (1973) suggèrent que deux activités enzymatiques différentes sont présentes dans le cytoplasme: l'une est dépendante du Mg ++ et est supprimée par des concentrations en sel relativement élevées, l'autre est dépendante du Mn ++ et plus résistante aux sels. La dernière activité de l'enzyme se retrouve également à l'intérieur de la particule virale (voir Ch. 5).

Concernant le produit de l'enzyme cytollasmique dans le système in vitro, des résultats contradictoires ont été obtenus. Ruck et al. (1969) ont rapporté que, dans leurs mains, cette enzyme synthétise au moins une partie de l'ARN de type virion (de 14 à 19S). Les auteurs sont parvenus à cette conclusion lorsqu'ils ont déterminé la composition des bases de produits dans le système in vitro après incubation de la fraction microsomale avec les quatre nucléosides triphosphates marqués au [3H] de radioactivité spécifique connue. Cependant, les données sur l’étude des

à l'acide adénylique des voisins obtenus dans le même travail en utilisant [(a-32P] ATP) sont cohérents avec l'analyse des voisins les plus proches obtenue par Scholtissek (1969), à la suite de laquelle il a été conclu que le produit était in vitro обладает структурой вкРНК. Mahy и Bromley (1970) в своей первоначальной публикации также заявили, что некоторая часть продукта в системе in vitro, полученного с помощью цитоплазматического фермента, должна 'быть вРНК. Однако недавно Hastie и Mahy (1973) при анализе ближайших соседей и специфической гибридизации подтвердили образование итоплазматическим ферментом почти исключительно вкРНК, как это было впервые показано Scholtissek (1969). Caliguiri и Compans (1973) также выделяли РНК-по-лимеразу из цитоплазмы клеток, зараженных вирусом гриппа, которая в системе in vitro синтезировала РНК, не менее 90% которой имеет последовательность оснований, комплементарную чвРНК. Hastie и Mahy (1973) «ашли, что значительный процент продукта в системе in vitro, синтезируемого ядерным ферментом в присутствии актиномицина D, не -был способен пибридизоватьея с немеченой вРНК- Пока неясно, какого типа РНК не способна к тако гибридизация. Очень малая часть РНК, синтезируемой при этих условиях, гибри-дизуется с немеченой акРНК (Scholtissek, неопубликованные данные).

Кинетика включения меченого ГТФ в вирусную РНК может быть интерпретирована как свидетельствующая о том, что реинициация синтеза РНК в системе in vitro отсутствует. Если неочищенный препарат фермента инкубируют при низких концентрациях солей, почти вся вновь синтезированная РНК изначально является однонитчатой. Однако после экстракции фенолом 'большой процент РНК становится РНК-азорезистентным. Фенол переводит промежуточную реплика-тивную структуру,, состоящую из однонитчатой матрицы и вновь синтезированной вкРНК, удерживаемых друг с другом в месте репликации молекулой' полимеразы, в частично дву-нитчатую структуру (Feix et al., 1967; Oberg, Philipson, 1971). Эти данные о продукте фермента вируса гриппа в системе in vitro можно интерпретировать таким образом, что полимераза не только инициирует и продолжает полимеризацию, но она отделяет вновь синтезированную цепь от своей матрицы. В противном случае образуется двунитчатая структура РНК, которая не обладает 'биологическими функциями (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Если инкубация проводится при высокой концентрации солей или с очищенным ферментом, большой процент продукта уже является двунитчатой РНК до экстракции фенолом (Schwartz, Scholtissek, 1973).

Это свойство РНК-нолимеразы вируса гриппа синтезировать исключительно вкРНК в системе in vitro -было исполь-

.зовано для установления генетического родства различных штаммов вируса гриппа по определению гомологии в последовательности оснований между ними (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).

IV. СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ

А. ТРАНСЛЯЦИЯ В СИСТЕМЕ IN VITRO

Проблема РНК какого типа—вир ионного или комплементарного — является 'информационной для синтеза вирусных белков, пока не решена. Были получены противоречивые результаты относительно вида вируеспецифической РНК, связанной с полисомами. Nayak (1970) обнаружил в поли-сомной области сахарозного градиента, главным образом вРНК, в то время как Pons (1972) выделил из полисам исключительно вкРНК. Последнее было подтверждено наблюдением, что после добавления через 2 ч после заражения актиномицина D, который предпочтительно воздействует на синтез вкРНК (см. раздел III, В, 1), в полисомах зараженных клеток вкРНК не обнаруживается (Pons, 1973).

Используя 'белоксинтезирующую систему из Е. coli и вРНК вируса гриппа как матрицу, Siegert и соавт. (1973) обнаружили образование вирусного NP-белка в условиях in vitro. Этот меченый NP-белок -был охарактеризован методом преципитации в геле по тесту Ouchterlony. В противоположность этому Kingsbury :и Webster (1973) не наблюдали никакого вирусного белкового синтеза с вРНК, использовав бе-локсинтезирующую систему, полученную из ретикулоцитов кролика. В этой же системе, однако, они выявили синтез вирусного М-белка (ом. гл. 2) на матрице РНК, изолированной из зараженных клеток. Таким образом, в настоящий момент нельзя ответить на вопрос, только ли вириопная или только комплементарная, или некоторые фрагменты РНК одного типа и некоторые фрагменты РНК другого типа используются как матрицы для синтеза белков. Следовательно, пока к вирусам гриппа трудно применять определение «отрицательная» или «положительная» вирусная цепь, как это предложено Baltimore (1971).

Б. СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ IN VIVO

Изучению синтеза вирусных 'белков 'благоприятствует то, что в зараженной клетке синтез полипептидов клетки замещается вирусспецифическим синтезом. В клетках фибробла-стов Куриного эмбриона, зараженных ВЧП (Joss et al., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973), и в клетках BHK 2IF зараженных ¦ штаммом WSN вируса гриппа (Lasarowitz et al., 1971), к 4-му часу после инфекции синтезируются почти

только одни вирусные белки (31). Несколько ранее исследователи в зараженных клешах наблюдали синтез трех или четырех полипептидов (Taylor et al., 1969; Joss et al.,. 1969; Holland, Kiehn, 1970; White et al., 1970). Впоследствии были обнаружены и другие полипептиды (Lazorowitz et al.,. 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Krug, Etkind, 1973). В целом в зараженных клетках были обнаружены все структурные -белки: один или два Р-белка, субъединица нуклеокап-оида NP, мембранный белок М, гемагтлютинияовый глико-протеин в нерасщепленной (НА) и расщепленной (НА1 и НА2) формах и субъединица NA.

Кроме вирионных 'белков, были описаны один или два неструктурных белка (NS).

Имеются заметные различия <в уровнях синтеза отдельных вирусных полипептидов. NP- и NS-полипептиды обычно первыми обнаруживаются в зараженных «летках. Skehel (1973) предположил, что полипептиды Р2, NP и NS, которые первыми обнаруживаются в «клетках, зараженных ВЧП, являются

продуктами фрагментов РНК, образуемых при селективной транскрипции вирионной полимеразой трех фрагментов вирусного генома. Когда «летки заражали в присутствии цик-.логексимида и пульсовую метку добавляли после удаления антибиотика, обнаруживались только три эти полипептида. На основании этого предположили, что молекулы РНК для этих .компонентов образовались с помощью вводимой вирионной лолимеразы в процессе первичной транскрипции. С 4-го по 6-й час после заражения куриных фибробластов ВЧП увеличивается уровень синтеза М-белка, а синтез NS-лолилепти-да уменьшается (Skehel, 1972, 1973). Таким образом, уровни синтеза иолипептидов могут индивидуально контролироваться и могут варьировать в течение цикла роста.

Кроме расщепления .полипептида НА на НА1 и НА2, нет данных о том, что вирусспецифические полипептиды вируса гриппа получаются в результате расщепления крупных предшественников (Taylor et al., 1969; Lazarowitz et al., 1971, Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973).

Недавно была получена новая информация о локализации вирусных компонентов в зараженных клетках при использовании авторадиографии (Becht, 1971) или методов фракционирования клетки и электрофореза в геле (Taylor et al., 1969, 1970). Согласно этим исследованиям, синтезы всех вирусных ¦белков осуществляются, по-видимому, в цитоплазме. Предыдущие исследования локализации нуклеолротеинового антигена методом иммунофлюоресценции интерпретировали как указывающие на то, что синтез осуществляется в ядре с последующим выходом антигена в цитоплазму (Liu, 1955; Brei-tenfeld, Schafer, 1957; Holtermann et al., 1960). Однако ясно, что иммунофлюоресценция определяет накопление антигена, .а не его синтез (см. раздел IV, Б, 2).

1. РНК-полимераза

Вирус-специфическая активность РНК-зависимой РНК-по-лимеразы может быть обнаружена в клетках, зараженных вирусом гриппа, между 13Д и 3 ч после инфекции в зависимости от использованной системы клеток (Scholtissek, Rott, 1969а; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970). Это первая выявляемая вирусспецифичеокая активность после заражения. Большая часть вирусной активности лолимеразы выявляется в микросомальной фракции; некоторая же часть этой активности остается в ядрах и не может ¦быть удалена оттуда даже интенсивным их промыванием. Фундаментальные отличия в кинетике проявления или в необходимых кофакторах между ядерным и микросомальным ферментами отсутствуют (Scholtissek, Rott, 1969a; Mahy et al., 1975).

При дальнейшем фракционировании цитоплазмы в ступенчатом сахарозном градиенте то методу Caliguiri и Tamm (1970) активность полимеразы обнаруживается в шероховатых мембранах (Compans, Caliguiri, 1973; Klenk et al., 1974a).

Поскольку активность вирусной полимеразы была обнаружена в очищенных вирусных частицах (см. гл. 5), возникает вопрос, с каким из вирусных 'белков она может быть ассоциирована. Полимераза, 'выделенная из клеток, зараженных вирусом гриппа, была очищена примерно в 200 раз. Единственным вирусспецифическим продуктом, ассоциированным с активностью полимеразы, был РНП-антиген (белок NP плюс вирусная вРНК, определенные то методу связывания комплемента). Все попытки удалить РНК из этого комплекса приводили к полной потере активности фермента (Schwarz, Scholtissek, 1973). Кандидатом на роль вирусной полимеразы был выдвинут Р-белок (Kilbourne et al., 1972). Когда ферментативный 'комплекс, меченный in vivo аминокислотами, выделяли из клеток, зараженных вирусом гриппа,, и очищали примерно в 35 раз, электрофоретический анализ выявил сначала в этом комплексе только ЫР-белоа< (Compans, Caliguiri, 1973). Впоследствии, однако, при других условиях введения ;метки удалось обнаружить и Р-белок (Caliguiri, Compans, 1974). С другой стороны, Klenk и соавт. (1974) обнаружили Р-белок в цитоплазматическом золе, 'который не обладает полимеразной активностью (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Эти наблюдения могут означать, что Р-белок осуществляет свою (Предполагаемую активность ферментов только при связывании с РНП-антигеном.

То, что сам по себе РНП-антиген обладает полимеразной активностью, маловероятно, поскольку гипериммунная сыворотка против РНП-антигена не ингибнрует активности полимеразы, тогда как конвалесцентная сыворотка, которая может содержать антитела к полимер азе, ингибирует ее (Scholtissek et al., 1971). Такая конвалесцентная сыворотка (которая была получена из животных, перенесших инфекцию вирусам гриппа А) инги'бировала активность полимеразы всех изученных штаммов вируса гриппа А, но не подавляла активность полимеразы вируса гриппа В. Все эти наблюдения согласуются, с идеей о том, что РНП-антиген (BPHK + NP = = белок), может служить матрицей для синтеза вкРНК-

2. Белок нуклеокапсида

NP-белок связывается с 'вирусной РНК, образуя РНП-антиген. Это верно для NP-белка, выделенного не только из вириона, но.и из зараженной клетки (Schafer, 1957). 'Серологическими средствами он может быть впервые выявлен, при-

мерно через 3 ч после заражения, за час до появления гемаг-глютинина (Breitenfeld, Schafer, 1957). По прошествии этого времени титр РНП-антигена существенно не увеличивается. Это может происходить вследствие равновесия между новым синтезом и включением в зрелые частицы. По метке NP-белок может 'быть обнаружен в зараженных клетках в течение 2-го часа после инфекции (Scholtissek, Rott, 1961; Krug, 1972).

С помощью флюоресцирующих антител РНП-антиген сначала обнаруживается в ядрах. Позже он появляется и в цитоплазме (Breitenfeld, Schafer, 1957). При определенных условиях, таких, как абортивная инфекция (Franklin, Brieten-feld, 1959), в присутствии р-флюорофенилаланина (Zimmer-mann, Schafer, 1960), или в условиях феномена фон-Магнуса (Rott, Scholtissek, 1963), РНП-антиген остается в ядрах.

Раннее накопление РНП-антигена в ядрах зараженных клеток не означает, что NP-белок также синтезируется внутри ядер.
Авторадиографические исследования, а также применение методов фракционирования клетки указывают на ц'итоплазматический синтез этого и другого, богатого аргинином, белка и на быстрый транспорт их из цитоплазмы в ядра (Taylor et al., 1969, 1970; Becht, 1971).

В экстрактах зараженных клеток определенная фракция РНП-антигена содержит вкРНК (Pons, 1971; Krug, 1972; Krug, Etkind, 1973), хотя в вирусных частицах находят только один тип РНК (что следует из отсутствия какой-либо самогибридизации вРНК) (Scholtissek, Rott, 1971; Pons, 1971). Невозможно решить, имеет ли РНП-антиген, содержащий вкРНК, специфическое значение в процессе размножения вирусов или он является лишь артефактом, появляющимся в процессе клеточного фракционирования. Было показано, что обе цепи РНК одинаково хорошо связываются с NP-белком in vitro (Scholtissek, Becht, 1971). Таким образом, если имеется сколько-нибудь свободного NP-белка и свободной вкРНК, в процессе гомогенизации незамедлительно образуется соответствующий РНП-антиген. Вирионная РНК .может быть вытеснена из РНП-антигена поливин'ИлсульфатО'М (Pons et al., 1969). Следовательно, можно проверить, осуществимо ли замещение различных вирусных РНК в РНП-антигене в клеточных гомагенатах. Из изменений состава оснований вирусной РНК, меченной в течение различных промежутков времени 32Р и выделенной из цитоплазматического РНП-антигена, Krug (1972) заключает, что некоторая часть вкРНК, прежде чем она включится в РНП-антиген, существует в виде, свободном от NP-белка. Включение 32Р в РНК жлеток животных происходит со значительной лаг-фазой из-за довольно медленного включения меченого,фосфора 'в '(х-положение нуклео-зидтрифосфатов (Scholtissek, 1965). До тех пор, пока соответствующие корректировки для расчетов изменений состава

оснований не сделаны, данные Krug (1972) следует интерпретировать с осторожностью.

Кинетический анализ «появления РНП-антигена в ядрах и цитоплазме, проведенный Krug (1972), -предполагает, что РНП-антиген, накапливающийся в ядрах, не является предшественником РНП-антигена, найденного в цитоплазме.

3. Неструктурные белки

Для зараженных клеток было описано несколько неструктурных вирусспецифических белков -неизвестной функции. Один из них с относительной молекулярной массой 25 000, накапливающийся в 'больших количествах, был обозначен как NS (Lazarowitz et al., 1971). В полиакриламидных гелях он имеет скорость миграции, близкую к подвижности М-бел-ка. Однако оба белка, по-видимому, не зависят друг от друга, как видно из различий в их пептидных картах. Большие 'количества NS-'белка обнаружены в ядрах (Lazarowitz et al.,. 1971; Krug, Etkind, 1973). Эти сведения согласуются с данными предыдущих иммунофлюоресцентных исследований Dim-mock (1969), который наблюдал 'яркое окрашивание ядер с антисыворопкой, специфичной ж неструктурным вирусным антигенам, и это окрашивание, вероятно, отражало наличие NS-'белка. Как 'было установлено, этот белок также является основным вирусспецифическим белком во фракциях свободных и связанных с мембранами рибосом, выделяемых из зараженных клеток (Pons, 1972; Compans, 1973; Klenk et al.,. 1974a). Ассоциация NS с рибосомами, по-видимому, зависит от тонной силы (Krug, Etkind, 1973). В буферах с низкой ионной силой ЭТОТ нолипаптид -адсорбировался на обеих ри-босомальных субъединицах, тогда как при добавлении соли удалялся от них.

Недавнее исследование (Gregoriades, 1973) выдвинуло некоторые сомнения в идентификации NS как неструктурного' полипептида, отличного от вирионного полипептида М. Оказалось возможным экстрагировать М-полип-ептид из вирионо© кислым хлороформметанолом, и белок с идентичной электрофор етвческой подвижностью может -быть также экстрагирован из целых зараженных клеток, -ядер или полисом. Анализ-продуктов триптическои обработки М-'белка, а также ядерного и ассоциированного с рибосомами -белков, привел к множеству совпадений, предполагающих, что М- и NS-белкй 'идентичны. Необходима, однако, дальнейшая информация для убедительного объяснения этих результатов.

В дополнение к NS могут существовать другие неструктурные вирусспецифические комлоненты, хотя ни один из них. не был достаточно охарактеризован. Используя антисыворотку, направленную против неструктурных вирусных антигенов,

Dimmock и Watson (1969) преципитировали радиоактивно меченные полипептиды из зараженных клеток. Электрофоре-тический анализ в полиакриламидном геле позволил предположить наличие нескольких неструктурных полипептидов с основным компонентом, соответствующим NS. Один из остающихся неструктурных компонентов мигрирует более быстро и может соответствовать компоненту с относительной молекулярной массой от 10 000 до 15 000, описанному Skehel (1972), Krug и Etkind (1973).

4. Мембранный М-белок

М-белок, который 'выстилает внутреннюю поверхность двойного липидного слоя оболочки и которым богат вирион, находят в зараженных клетках в относительно небольших количествах. Это предполагает не только контролируемость синтеза М-белма, но и возможность того, что этот синтез является лимитирующей стадией репродукции вируса (Lazarowitz et al., 1971). Эту концепцию поддерживают данные о том, что при температуре 29 °С, при которой образование вируса подавлено, М-белок является единственным (вирусопе-дифическим белком, который нельзя обнаружить в зараженных клетмах (Klenk, Rott, 1973).

М-белок {можно обнаружить на гладких и плазматических мембранах зараженных клеток (Lazarowitz et al., 1971; Corn-pans, 1973a; Klenk et al., 1974a). Эти данные свидетельствуют о сродстве этого белка к мембранам.

5. Гемагглютинин

Гемагглютинин синтезируется как большой гликопроте-ин — предшественник НА, который впоследствии расщепляется на два меньших гликопротеина: HAi и НА2 '(Lazarowitz «t al., 1971). Расщепление, которое можно подавить ингибиторами протеаз (Klenk, Rott, 1973), осуществляется, по-видимому, протеолитическими ферментами клетки-хозяина (Lazarowitz et al., 1973). Степень расщепления зависит от штамма вируса, клетки-хозяина, уровня цитоиатического эффекта и присутствия или отсутствия в среде сыворотки (Lazarowitz et al., 1971, 1973а, b; Klenk, Rott, 1973; Stanley et al., 1973). Так, ВЧП, выращенный в культуре фибробластов куриного эмбриона, содержит только расщепленные глишпротеины ге-магглютннина, тогда как такое расщепление фактически отсутствует, если выращивать вирионы WSN в клетках MDBK в отсутствие сыворотки. В присутствии сыворотки, однако, гемагглютинин WSN также расщепляется. Расщепление в этой

системе имеет место на .плазматической мембране (Lazaro-witz et al., 1973a). В системе ВЧПмеханизм такого расщепления, по-видимому, другой. Расщепление «происходит .на внутриклеточных мембранах, и плазминоген в этом случае не является необходимым (Щепк et al., 1974a). Степень расщепления резко уменьшается три 25 °С (Klenk, Rott, 1973).

Расщепление НА не является необходимым условием для гемагглютинирующей активности и для сборки вириона (La-zarowitz et al., 1973a; Stanley et al., 1973), но исследования,, проведенные недавно, 'обнаружили, что оно необходимо для инфекционности (Klenk et al., 1975b). Эти данные согласуются с гипотезой о том, что, помимо своей роли в адсорбции, НА* имеет и другую функцию в инфекционном процессе и что расщепление необходимо для этой функции. На основании того, что расщепление НА является феноменом, зависящим от «летки-хозяина, и что частицы, содержащие нерасщеплен-ный НА, обладают низкой инфакционностью, предполагают зависимость диапазона хозяев и распространения инфекции вируса гриппа от присутствия протеазы клетки-хозяина как. активирующего фермента.

В опытах по фракционированию «леток, зараженных ви

русом гриппа, обнаружено,, что гликопротеины НА всегда ас

социированы с мембранами (Compans, 1973a; Klenk et al.,.

1974а). Внутриклеточная локализация этих белков ж их миг

рация от шероховатых мембран к гладким эндоллазматиче-

ского ретикулума и к плазматическим мембранам будут де

тально описаны в разделе VII, В. . .,

6. Нейраминидаза

Вирусная NA* как активный фермент была обнаружена,

через 3 ч после инфекции в хорион-аллантоиеных мембра

нах, и путем экстраполяции установлено, что начало ее син

теза приходится на 1—2-е часы после заражения (Noll et al.,

1961). Внутриклеточную локализацию NA* исследовали пу

тем фракционирования клеток, и нашли, что она, по-видимо

му, подобна локализации НА* (Compans, 1973a; Klenk et al.,,

1974а). NA* была обнаружена в ассоциации с мембранами,

полученными из гладкого эндоплазматичеекого ретикулума,

при определении ее по биологической активности и по анали

зу в полйажриламидном геле. Активность фермента была най

дена также во фракциях, содержащих шероховатые мембра

ны. Эти данные согласуются с данными, полученными при

иммунофлюорееценции (Maeno, Kilbourne, 1970). Через 4 ч

после заражения яейраминидазу можно обнаружить в цито

плазме; позже она, по-видимому, концентрируется на пери

ферия клетки.

V. СИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ

Углеводы участвуют в образовании гликопротеинов и гли-колилидов оболочки вируса гриппа (Klenk et al., 1972a). Гли-колипиды миксовирусов (происходят из плазматических мембран клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1970), «о не было определено, что преимущественно (включается в вирион: уже существовавшие или вновь синтезированные гликолипиды.

Использование радиоактивных предшественников, таких, как глюкозамин, манноза, галактоза и фукоза, которые специфически включаются в вирусные глмкопелтиды, показало, что углеводные боковые цепи этих гликопептидов вновь синтезируются в процессе инфекции (Haslam et al., 1970; Corn-pans et al., 1970a; Schwarz, Klenk, 1974). Опыты по фракционированию (клеток дали дополнительную информацию о местах гликозилирования вирусных гликопротеинав. Глюкозамин ассоциирован с НА-полипептидом во фракциях как гладких, так и шероховатых цитоплаэматических мембран; однако фукоза ассоциирована с НА в гладких, но не в шероховатых мембранах (Compans, 1973b). .Подавление белкового синтеза пуромицином почти незамедлительно останавливает включение глюкозамина, в то время как фукоза еще продолжает включаться в течение примерно 10—15 мин (Stanley et al., 1973). Наконец у FPV гликопротеид — предшественник НА и продукты расщепления HAj <и НА2 содержат, по-видимому, полный состав маннозы « глюкозамина, тогда как содержание фукозы и галактозы значительно выше в продуктах расщепления (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Эта наблюдения предполагают, что биосинтез углеводных боковых целей гликопротеинов НА осуществляется по стадиям с различными остатками Сахаров, добавляемыми в разных участках клетки. Глюкозамин и манноза (присоединяются, по-видимому, к полипептидам НА на шероховатых мембранах вскоре после или даже в процессе синтеза поляпептида, в то время как фукоза, вероятно, прикрепляется позже с помощью трансфераз, присутствующих в гладких мембранах.

Эти гликозилтрансферазы являются, вероятно, ферментами клетки. Следовательно, углеводная (часть гликопротеидов определяется, по-видимому, клежой-хозяином. Имеются, однако, свидетельства того, что в дополнение к этим ферментам клетки-хозяина существенную роль в образовании углеводных боковых цепей играет вирусная NA*. Установлено, что поверхность оболочек микеовирусов лишена нейраминовой кислоты (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970), в то время как в вирусных оболочках, которые не содержат этого фермента, такой углевод является обычной составной частью (Klenk, Choppin, 1971; McSharry, Wagner, 1971; Renkonen et al., 1971). Эти данные позволяют предположить, что отеут-

ствие нейраминовой кислоты является существенной особенностью миксовирусов. Недавно удалось показать, что NA* ответственна за удаление нейраминовой кислоты из оболочки вируса гриппа, предотвращая тем самым образование на вирусной оболочке (рецепторов, которые в противном случае приводили оы к образованию больших агрегатов вирусных частиц (Palese et al., 1974). Эти данные поддерживают концепцию, что углеводная часть НА* как основного поверхностного гликопротеина является продуктом •комбинированного действия (Клеточных транефераз и вирусной NA*. Благодаря ее действию вирус способен вводить вирус-специфическую модификацию в (Первоначально специфичную для хозяина, сложную структуру углевода—модификацию, которая, по-видимому, существенна для -биологической активности вируса.

D-глюкозамин и 2-дезокси-0-глк>коза ингибируют образование биологически активного НА*, NA* и инфекционного вируса (Kilbourne, 1959; Kaluza et al., 1972). Биохимические исследования выявили, что эти сахара .конкурируют с биосинтезом вирусных гликоггротеинов (Ghandi et al., 1972; Klenk et al., 1972b). В присутствии этих ингибиторов размер глигко-пр'отеидов НА уменьшается. Степень уменьшения зависит от дозы. Так, при увеличении концентр!ации сахара гликопроте-пд НА с относительной молекулярной массой 76 000 постепенно превращается в соединение с молекулярной массой 64 000, которое было обозначено как HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974). Сдвиг молекулярной массы параллелен уменьшению содержания углеводов и, как -было установлено, белок HA0 почти свободен от углеводов (Schwarz, Klenk, 1974). Эти результаты показывают, что HA0 является не полностью гликозилированной или «егликозилированной полипептидной цепью гликопротеина НА и что «нгибирующее действие D--глюкоз амин а и 2-дезокси-0-глюкозы осуществляется благодаря повреждению гликозилирован-ия. Полипептид HA0 ассоциирован -с мембранами, как -и нормальный НА. Он также мигрирует от шероховатого к гладкому эядопла-з-¦матичеокому ретикулуму, где расщепляется на полипептиды НА01 и НА02. Следовательно, углеводы, -вероятно, несущественны для сродства этого полипептида к мембране. Однако отсутствие гемагглютинирующей активности в зараженных клетках предполагает, что негликоз-илированный белок не способен связываться с рецепторами.

VI. СИНТЕЗ ЛИПИДОВ

Как и все вирусы, обладающие оболочкой, вирус гриппа приобретает свои липиды путем утилизации липидов клетки-хозяина. Это положение подтверждается следующими наблю-

дениями. Липидный состав вируса гриппа, как было установлено, -аналогичен таковому клетки-хозяина (Ambruster, Beiss, 1958; Frommhagen et al., 1959). Липиды клетки-хозяина, радиоактивно меченные -перед заражением, включаются в вирусные частицы (Wecker, 1957). При выращивании вируса в различных клетках-хозяевах выявляются модификации вирусных липидов (Kates et al., 1961, 1962). Вообще липиды вирусов, (которые ¦отпочковываются от клеточной поверхности, близко отр!ажают липидный состав плазматической мембраны клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1969; 1970а, b; Renko-nen et al., 1971). Уровень синтеза de novo ф-осфолилидов в клетках фибро-бластов куриного эмбриона оставался неизменным в течение 7 ч после заражения вирусом гриппа; после этого весь синтез липидов был подавлен (Blough et al., 1973). Это подавление, вероятно, не является первичным эффектом, а может быть вторичным по отношению к инги-биро-ванию синтеза РНК или белка или к '.другим цнтолэтическим эффектам.

Таким образом, на основании результатов, полученных к настоящему времени, можно предположить, что синтез вирусных липидов осуществляется посредством нормальных клеточных процессов биосинтеза липидов, а вирусная оболочка формируется путем включения липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина.

VII. СБОРКА (см. также гл. 2)

А. ОБРАЗОВАНИЕ НУКЛЕОКАПСИДА

Как уже говорилось, наиболее вероятно, что белок нук-леокапсида синтезируется в цитоплазме. По-видимому, он присутствует там в течение короткого времени в свободной форме, а затем ассоциирует с вирусной РНК, образуя нук-леокапсиды (Klenk et al., 1974; Compans, Caliguiri, 1973). Поскольку NP-белок -быстро включается в яуклеокапсиды, РНК может отбираться из ^реформированного пула (Krug, 1972). Вследствие малых размеров нуклеокапсидов вируса гриппа они не могут быть точно идентифицированы в зараженных клетках с помощью электронной микроскопии. Скопления нитей или волокон диаметром около 5 нм, наблюдаемые в цитоплазме, возможно, представляют вирусные рибо-нуклеопротеины (Apostolov et al., 1970; Compans et al., 1970b).

Имеющиеся данные указывают на то, что РНК-геном вирионов вируса гриппа состоит из 5—7 фрагментов (см. гл. 6).

Следовательно, любая инфекционная частица нуждается хотя бы в одной копии каждого фрагмента. Hirst (1962) пред-

положил, что нуклеокапсиды из внутриклеточного пула могут включаться в (вирионы случайно. Доля 'инфекционных вирио-нов Е популяции может быть увеличена путем включения дополнительных фрагментов РНК в средний вирной (Compans et al., 1970). Например, если для инфекционное™ необходимы пять различных фрагментов РНК, во каждый вирной содержит в целом 7 фрагментов, включенных в вирной случай.ю, то приблизительно 22% вир-ионов должны быть инфекционными. Свидетельства в пользу случайного включения фрагментов РНК были подкреплены недавними наблюдениями Hirst (1973) о том, что в вирусной популяции осуществляется рекомбинация между частицами, не образующими бляшек. Способность таких частиц участвовать в рекомбинации можно объяснить отсутствием одного или более фрагментов в частицах при варьировании отсутствующих фрагментов от одной частицы к другой; таким образом, подходящие нары дефектного вируса могут образовывать рекомбинанты.

Б. ПРОЦЕСС ОТПОЧКОВЫВАНИЯ ВИРУСА

Как и большинство вирусов, имеющих оболочку, вирус гриппа собирается на преформированных мембранах клеток; сборка осуществляется путем отпочковывания от плазматической мембраны. Первая демонстрация освобождения вируса от «летки с помощью процесса, не включающего лизис, 'была представлена Murphy и Bang (1952) в ранних электронно-микроскопических исследованиях клеток, зар;аженных вирусом гриппа. Были видны выступающие от 'поверхности клетки во внеклеточное пространство нитевидные и ¦ шарообразные структуры. Вирусных частиц внутри клеток во время образования 'инфекционного вируса не было видно и. из этого, следовательно, явствовало, что вирусные частицы формировались на поверхности клетки. Используя меченные ферритином антитела, Morgan и со авт. (1961) наблюдали, что поверхность (клетки содержит вирусный антиген в тех областях, где формируется вирус. Более поздние электронно-микроскопические исследов;ания показали, что поверхность отпочковывающегося вируса содержит такую же, как и клетка-хозяин, мембрану со слоем выступов, соответствующих вирусным «шипам» на внешней поверхности. На внутренней поверхности вирусной мембраны имеется отсутствующий на поверхности клетки дополнительный электронно-плотный слой, который, вероятно, состоит из М-иолипептидов (Bachi et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Apostolov et al., 1970).

Исследования в электронном микроскопе дали основания ¦предположить порядок, в котором вирусные компоненты ас-

социируют на мембране клетки (Bachi et al., 1961; Compans, Dimmock, 1969; Compans et al., 1970b).

Первыми появляются белки вирусной оболочки, включаясь в некоторые области мембраны, которые должны иметь нормальную морфологию; однако .наблюдаемая специфическая адсорбция эритроцитов на этих областях мембраны указывает на присутствие здесь .НА-белка. Затем, по-видимому, М-белок (ассоциирует с внутренней поверхностью таких областей мембран, формируя электронно-плотный слой. Далее с мембраной в этих областях специфически связывается рибо-нуклеопротеин и происходит процесс отпочкования путем изгибания и выпячивания сегмента мембраны и окружения ассоциированного рибонуклеопротеина. Данные электрофореза в полиакриламидном геле также поддерживают идею о том, что белки оболочки ассоциируют с плазматической мембраной быстрее, чем РНП (Lazarowitz et al., 1971). Полипептиды клетки-хозяина вытесняются из мембраны, которая является предшественником оболочки вируса, так как подобные полипептиды не обнаруживаются в очищенных вирионах. Как уже упоминалось, остатки нейраминовой кислоты отсутствуют в оболочке отпочковывающихся частиц вируса гриппа, но присутствуют в соседних участках мембраны клетки (Klenk et al., 1970).

Эти данные доказывают резкий переход в химическом составе между оболочкой отпочковывающейся вирусной частицы и соседствующей мембраной клетки.

Однако, с другой стороны, важной особенностью процесса отпочкования является то, что вирусная оболочка непрерывна с плазматической мембраной клетки-хозяина и морфологически подобна ей (Compans, Dimmock, 1969). Как было упомянуто, липиды в этих оболочках имеют очень близкое сходство с липидами мембраны клетки-хозяина. Эти наблюдения предполагают, что липиды в неизмененной плазматической 'Мембране легко обмениваются с липидами в отпочковывающихся вирусных частицах путем радиальной диффузии.

Следовательно, оболочка отпочковывающегося вириона образуется из небольшого участка мембраны клетки, модифицированного включением белков оболочки вириона. Эта концепция, конечно, не заключает в себе необходимость синтеза ' всех компонентов оболочки на плазматической мембране.

Действительно, в течение длительного времени было известно, что составные части оболочки должны мигрировать на значительные расстояния из одного участка клетки в другие, чтобы добраться от места своего биосинтеза :к месту сборки оболочки. Breitenield и Schafer (1957) показали, что в клетках, зараженных вирусом гриппа, НА* сначала можно уви-

деть во всех частях .клетки и что он ш повышенной -концентрации локализован в околоядерной зоне. Позднее НА* накапливается в 'периферической области «летки, а также может быть продемонстрирован в тонких нитях, которые выступают из мембраны клеши.

Представление о том, что компоненты оболочки мигрируют изнутри «летки ,к поверхности, недавно было подтверждено и расширено серией работ с использованием фракционирования клеток и анализа вирусных белков в различных фракциях клеток. Эти работы также дают основание предполагать, что гликопротеин НА, а возможно, и другие белки оболочки синтезируются на шероховатом эндоплазматиче-оком ретикулуме (Compans, 1973a; Klenk et al., 1974). Как выявляется в пульс-чейз-экспериментах, через несколько минут НА обнаруживается уже в мембранах гладкого эндо-плазматического ретикулума (Compans, 1973a; Stanley et al.,. 1973; Klenk et al., 1974) и в плазматической мембране (Stanley et al., 1973). Хотя опыты по чейзу из гладкого эндоплаз-матического ретикулума в плазматическую мембрану и не были проведены, кажется правдоподобным, что НА мигрирует из шероховатого эндаплазматического ретикулума ас плазматической мембране, минуя гладкий эндошгазматиче-ский ретикулум. Следует отметить, что в течение всего времени такой миграции НА и другие белки оболочки являются составными частями мембран, вдоль которых они движутся; ОБИ никогда не обнаруживаются в виде растворенных белков.

Во фракциях гладких мембран, которые, как полагают, происходят главным образом из эндоплазматнческого ретикулума, находят все основные белки оболочки (Compans 1973a; Klenk et al., 1974). Однако их относительные .количества здесь отличаются от таковых в плазматической мембране и вир ионе (Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974). Соотношения М-белка к лликопротещдам НА более высокое в оболочке зрелого вириона, чем в мембранах эндоллазматичеокого ретикулума. Эти данные позволяют предположить, что лишь небольшое количество мембран, несущих гликопротеин НА, превращается в вирусную оболочку, а именно фракции мембран, в состав которых входят л белки, свободные от углеводов. Как уже указывалось, синтез М-белка может быть той стадией, которая лимитирует процесс сборки .вируса.

Различие скорости синтеза разных белков оболочки поддерживает 'гипотезу о том, что сборка оболочки—процесс многостадийный. С этой концепцией согласуется вопрос о процессе образования НА*, включающем последовательное присоединение углеводной части и протеолитическое расщепление в ходе миграции первичного генного 'продукта.

Viii. ОСВОБОЖДЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА

Проблема освобождения вируса гриппа из клетки-хозяина,

по-видимому, тесно связана с проблемой функции вирусной

NA*, о которой уже детально говорилось ранее (см. раз

дел V и гл. 4). То, что этот фермент играет существенную

роль в освобождении вируса, вытекало из способности анти

тел, специфичных к NA*, подавлять такое освобождение (Se-

to, Rott, 1966; Webster et al., Г968). К тому же такие антитела

предотвращают элюцию вируса с эритроцитов (Brown, Laver,

1968). Бактериальная NA*, которая не ингибируется антите

лами к вирусной NA*, способна освобождать вирус от клеток,

обработанных такими антителами (Compans et al., 1969;

Webster, 1970). С другой стороны, двухвалентные антитела

к NA также вызывают агрегацию вируса (Seto, Chang, 1969;

Compans et al., 1969; Webster, 1970), а одновалентные анти

тела не препятствуют освобождению вируса, хотя ингибируют

более 90% активности нейраминидазы (Becht et al., 1971).

Все эти данные, вместе взятые, позволяют предположить, что

двухвалентные антитела препятствуют освобождению вируса

путем связывания его с антигенами, присутствующими на по

верхности клетки, и путем ингибирования активности фер

мента. Роль нейраминидазы в освобождении вируса показа

ли также Palese и еоавт. (Г974), установившие, что этот фер

мент необходим для удаления нейр амиловой кислоты с ви

русной поверхности во избежание агрегации вирионов-потом-

ков на поверхности клетки.

IX. НЕПРАВИЛЬНЫЕ ФОРМЫ РАЗМНОЖЕНИЯ

А. АБОРТИВНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ, ЗАВИСЯЩЕЕ ОТ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

Вирусы гриппа могут заражать широкий набор клеток-хозяев. Однако во многих из зараженных клеток выход инфекционного потомства или очень низок, или вообще не 'Определяется, хотя вирусные компоненты можно обнаружить в обычных титрах. Этот тип зависящего от клетки-хозяина прерывания инфекционного цикла называют абортивной инфекцией. Такой абортивный инфекционный цикл первоначально наблюдали у мышей, зараженных в мозг ненейротропньши штаммами вируса гриппа (Schlesinger, 1953). Чем выше была вводимая доза вируса, тем -больше было количество вновь синтезированного гемагглютинина. Было описано несколько других систем клетка-хозяин—вирус гриппа А, в которых продуцировались только РНП-^антиген и гемагглютинин, но не инфекционный вирус. Во всех этих исследованных до сих лор системах РНП-антиген накапливался в ядре и не обна-

руживался с помощью флюоресцирующих антител в цитоплазме (Henle et al., 1955; Franklin, Breitenfeld, 1959; Ter Meulen, Love, 1967; Fraser, 1967).

Б. ФЕНОМЕН ФОН-МАГНУСА

В процессе серийных пассажей 'вирусов гриппа при множественности выше, чем 1 (Barry, 1961), образуются увеличивающиеся -количества неполного вируса, выходящего из. клетки-хозяина (von Magnus, 1951, 1952). Эти вирусные частицы имеют поверхностную структуру, очень похожую на. структуру инфекционного вируса, являются иммуногенными: и вызывают гомологичную интерференцию. Они содержат меньше РНК и РНП-антигена, проявляют меньшую величину отношения инфекционности к гемагглютинирующей активности и содержат больше липидов, чем полные вирусные частицы (von Magnus, 1954; Isaacs, 1959; Pauker et al., 1959; Rott,. Schafer, 1961; Rott, Scholtissek, 1963).

При анализе РНК неполного вируса обнаружено, что вирусная РНК с относительно высокой [молекулярной массой или отсутствует или присутствует в них в уменьшенных количествах, тогда как количество РНК с низкой молекулярной массой увеличивается (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969; Nayak, 1969).

В клетках, зараженных вторым неразведенным пассажем вируса гриппа, .присутствует вся генетическая информация вируса, поскольку вкРНК, выделенная из этих «леток, способна превращать после гибридизации меченую РНК, выделенную из инфекционного вируса, в полностью РНК-азорези-стентную форму (Scholtissek, Rott, 1969b). Таким образом, увеличение .количества РНК с низкой молекулярной массой в неполных частицах .может шроисходить за счет РНК с большой молекулярной массой, которая может включаться в эти частицы в виде разрушенных и, следовательно, нефункцио-нирующих молекул. Эта идея поддерживается данными, что с жаждым неразведенным пассажем прежде ©сего падает способность продуцировать инфекционный вирус, после чего уменьшается синтез гемагглютинина, нейраминидазы и, наконец, РНП-антигена (Scholtissek et al., 1966).

Nayak (1972) установил, что в течение первого пассажа с высокой множественностью вирус, выходящий вначале, был полностью инфекционен и давал в сахарозном градиенте нормальную картину фрагментов РНК инфекционного вируса, тогда как вирус, выходящий позже, имел профиль РНК, типичный для неполного (фон-магнусовокого) вируса1.
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Репликация вируса гриппа

  1. Effets au niveau de la réplication des virus sur une cellule
    La réplication virale peut déplacer la chromatine cellulaire vers la périphérie du noyau (virus de l'herpès), perturbant le processus normal de doublement de l'ADN hôte. 2. Les protéines virales peuvent dégrader l'ADN cellulaire (la virion DNAse des poxvirus pénètre dans le noyau et se dégrade sur l'ADN). 3. Dans la réplication, les virus utilisent des protéines cellulaires réplicatives pour synthétiser leurs acides nucléiques,
  2. Annexe 4 Grippe causée par le virus de la grippe A (H5N1) (grippe aviaire)
    La grippe aviaire est une infection virale hautement contagieuse qui peut toucher toutes les espèces d'oiseaux. Parmi les espèces domestiques, les dindes et les poulets sont les plus sensibles. Les oiseaux sauvages peuvent transmettre l'infection. Le réservoir naturel des virus de l'influenza aviaire (AIV) est la sauvagine, qui est le plus souvent responsable de l'introduction de l'infection dans les ménages. L'étiologie. AHP appartient à
  3. Les principes et mécanismes de base de la réplication des génomes d'ADN des virus
    Préparer les cellules pour la réplication de l'ADN viral. Lors d'une infection virale productive, de nombreux virus à ADN provenant d'une seule molécule du génome peuvent recevoir 100 000 copies ou plus du génome en quelques jours. Cela nécessite le travail de nombreuses protéines, y compris les protéines de liaison à l'ADN et les polymérases, ainsi qu'un approvisionnement abondant en nucléotides. La réplication de certains virus à ADN ne se produit que
  4. Kilburn ED. Virus grippaux et grippe (1978), 1978
    Le livre est consacré à une revue d'une variété de virus grippaux, leur culture, leur biochimie et leurs caractéristiques moléculaires. Contenu: Grippe et virus grippaux. La structure du virus de la grippe. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase. Activité de transcriptase dans les cellules et les virions de la grippe. Virus Ribonucleic Acids
  5. La culture des virus de la grippe humaine en laboratoire, le cercle d'hôtes parmi les animaux de laboratoire et l'isolement du virus du matériel clinique
    B.R.DAUDLE et G.S. SCHILD aux virus de la grippe (Schafer, 1955). En 1931, Shope passa la grippe porcine «classique» en administrant par voie intranasale un filtrat de sécrétions respiratoires. Premières données sur
  6. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions
    RV OIMPSON et VD BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. INTRODUCTION Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, et donc la plupart des informations sont fragmentées dans sa composition de si un grand nombre de problèmes non résolus. La principale déclaration sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus génomiques négatifs.
  7. Virus de la grippe et grippe
    E. D. KILBOURNE I. INTRODUCTION. INFLUENZA - UNE MALADIE AUX SYMPTOMATIQUES INCHANGEABLES, CAUSÉE PAR UN VIRUS CHANGEABLE L'énorme intérêt suscité par la virologie moderne pour la grippe et les virus responsables de son apparition nécessite une explication, étant donné la nature ordinaire des symptômes de cette infection respiratoire, généralement très légère,
  8. Structure du virus de la grippe
    P.V. SHOPPIN ET R.V. KOMPANS (PW CHOPPIN, J. W. COMPANS) I. INTRODUCTION L'étude du virus de la grippe est depuis longtemps «à la pointe des études structurales en virologie. Le virus de la grippe a été l'un des premiers à être étudié: en utilisant la microscopie électronique (Taylor et al., 1943), et lors de l'utilisation de cet objet particulier comme modèle, il a été «constaté que certains virus
  9. Variabilité antigénique du virus de la grippe
    RG WEBSTER et WG LEIVER i (RG WEBSTER et WG LAYER) I. INTRODUCTION Le virus de la grippe de type A1 est unique parmi les agents pathogènes des maladies infectieuses humaines en raison de sa capacité à modifier sa propre structure antigénique au point que l'immunité spécifique acquise la réponse "et l'infection par une souche est très faible ou ne protège pas contre la suivante
  10. Génétique du virus de la grippe
    A. SUGIURA I. INTRODUCTION. REVUE HISTORIQUE Ce chapitre n'est pas écrit pour donner un aperçu de toute la littérature relative à l'étude de la génétique du virus de la grippe. Cela se fait plus en détail dans les revues de Kjlbourne (1963) et Hoyle (1968). J'ai essayé de tracer, en essayant d'adhérer à l'ordre chronologique, uniquement pour les données qui ont directement conduit à des concepts importants et
  11. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  12. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine
    I. T. SCHULZE (I. T. SCHULZE) I. INTRODUCTION Le fait que les virus de la grippe ont la capacité d'agglutiner les globules rouges a joué un rôle important dans le développement de nos idées sur ces particules infectieuses. L'hémagglutination s'est révélée être une méthode extrêmement pratique pour identifier, purifier et déterminer la concentration de virus. De plus, depuis (le moment de la découverte du phénomène d'hémagglutinacip il y a 35 ans
  13. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase
    D. BOOKER et P. PALEYSE I. BUCHER I. INTRODUCTION L'existence de la neuraminidase a été suggérée pour la première fois dans le travail désormais classique de Hirst (1942). Il a constaté que si les globules rouges agglutinaient en présence du virus de la grippe désagglutiné, alors lorsqu'un nouveau virus leur était ajouté, ils ne pouvaient à nouveau pas s'agglutiner. Cependant, le virus élué ne
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com