Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

Virus de la grippe acides ribonucléiques

M.V. LONS (M. W. PONS)

I. INTRODUCTION

Le virus de la grippe possède un spectre unique de propriétés biologiques par rapport aux autres virus animaux. Il a la capacité de réactivation multiple (Hoyle, Liu, 1951), la formation de particules virales incomplètes (von Magnus, 1954), est sensible à l'antinomycine D (Barry et al., 1962), son acide nucléique est non infectieux, et il a la capacité de génétique recombinaison (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Cette dernière propriété nous a permis de suggérer que le génome du virus de la grippe se compose de deux fragments ou plus d'acide ribonucléique simple brin (ARN), et non d'une chaîne de nucléotides liés par covalence (Burnet, 1956; Hirst, 1962). Par la suite, cette hypothèse biologique a été confirmée par l'analyse biochimique de l'ARN isolé des extrusions (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1968a), et le fait que la forme réplicative intracellulaire de l'ARN du virion existe également sous forme de fragments séparés (Pons. Hirst, 1968) .

L'acide ribonucléique du virus de la grippe représente 0,8 à 1,1% du poids sec de la particule virale (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). L'analyse chimique d'ARN isolé de virions purifiés nous a permis d'estimer la masse d'ARN 2-U6-3-U6 contenue dans une seule particule virale (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956). La valeur obtenue est cependant sans doute trop faible. Bien qu'il soit assez proche de la valeur généralement acceptée de 4,5-10 s - ARN 5-U6 »et d'un virion, un pourcentage d'ARN trop faible dans le virion grippal, et aussi (ou) la présence de virus incomplets dans la population virale peut entraîner une estimation sous-estimée ARN, qui fait partie d'une particule virale (voir la section BC).

II. MÉTHODES

A. CULTURE ET NETTOYAGE DES VIRUS D'INFLUENZA

Il existe plusieurs méthodes différentes pour nettoyer les virus de la grippe. La méthode décrite ici est constamment utilisée dans notre laboratoire, ainsi que, avec des modifications mineures, dans certains autres groupes scientifiques. La méthode convient également à la purification d'un virus cultivé à la fois sur des embryons de poulet et sur une culture monocouche de fibroblastes d'embryons de poulet (CEF). De plus, en utilisant cette méthode, des préparations de virus de haute pureté sont obtenues avec un rendement de 40% par rapport à la quantité initiale de virions avec une très faible perte d'activité infectieuse ™ et d'hémagglutination. À l'heure actuelle, d'autres méthodes de nettoyage ont été décrites (en particulier, en utilisant du sulfate d'ammonium pour la précipitation), qui produisent également des préparations virales de haute pureté, mais la concentration élevée en sel utilisée dans ces méthodes a un effet indésirable sur l'infectiosité des virions. Il convient de noter que la principale exigence des méthodes décrites ici était de minimiser l'effet sur l'infectiosité du virus.

Dans la plupart des études biochimiques effectuées sur des virus grippaux américains, la souche WSN a été utilisée comme objet d'étude. En Europe, cependant, l'attention s'est concentrée sur l'étude du FPV, une autre souche du virus de la grippe A. Les différences entre les deux souches (en particulier, dans les acides nucléiques et leur réplication) ne sont probablement pas particulièrement importantes.

La souche WSN est généralement cultivée dans une culture de fnbroblastes d'embryon de poulet primaire (CEF). Pour obtenir de grandes quantités de virus [de l'ordre de 5-10-10-10-10 unités formant des plaques (PFU)], 40 à 60 monocouches continues sont inoculées avec un virus avec une multiplicité d'infection d'environ 5-10 "5 PFU par cellule. Les monocouches sont incubées à 37 ° C pendant 40 h dans une atmosphère de 5% de CO2 (Simpson et Hirst, 1961), et le virus est isolé du sulfatant selon la procédure décrite ci-dessous. Pour obtenir un virus radiomarqué, les isotopes nécessaires, généralement la [3H] -5-uridine (2-5 M'KK! Et / ml) ou les acides aminés [3H] ou [14C], sont ajoutés au système immédiatement avant l'incubation à 37 ° C. (2-4 µcCi / ml).

Après traitement avec l'ARN-ase, le virus est déposé sur 4 ml de saccharose à 30% dans du tampon STE et centrifugé pendant 1 h à 145 000 g. Un tampon STE est ajouté au culot, le mélange est homogénéisé pour remettre en suspension complètement le virus et centrifugé pour éliminer les débris à faible vitesse. Le surnageant est stratifié sur un gradient de saccharose linéaire (10 ml de saccharose à 30-60% dans un tampon STE), recouvert d'une couche d'huile minérale (10 ml) et centrifugé à l'équilibre pendant 17 heures à 96 000 g. La couche visuellement visible du virus est détectée dans la plage de densité 1,18-1,19 g / cm3 et sélectionnée par fractions (1 ml), en partant du bas du tube. Le saccharose est éliminé de la suspension virale soit par chromatographie sur Sephadex G-50, soit par sédimentation du virus par centrifugation pendant 60 minutes à 145 000 g et remise en suspension du culot dans du tampon STE.

B. EXTRACTION D'ARN VIRION

1. Extraction d'ARN à partir de virions

Le virus, purifié par la procédure décrite et précipité pour éliminer le saccharose, est transféré dans un petit volume de tampon STE (généralement 0,2-0,4 ml). Après remise en suspension complète du précipité, ajouter 1 à 2 ml de tampon SLA (0,5% SDS, 0,14 M LiCl dans un tampon acétate 0,01 M, pH 4,9) et un volume égal d'un mélange de phénol saturé d'eau fraîchement distillé avec du chloroforme (1: 1) . Le mélange est agité manuellement pendant 4 minutes, les phases sont séparées par centrifugation à faible vitesse et la couche aqueuse supérieure est soigneusement aspirée sans violer l'intégrité de l'interphase. Après avoir ajouté un double volume d'éthanol à 95%, l'ARN précipite une nuit à une température de -20 ° C, le précipité est séparé par centrifugation, dissous dans un tampon approprié et précipité à nouveau avec de l'alcool. Si vous prévoyez d'effectuer une analyse d'ARN en utilisant

PAGE, il est extrêmement important que l'ARN après la première précipitation avec de l'alcool soit dissous dans un tampon d'électrophorèse (EDTA 5 mM, NaCl 10 mM, SDS 0,05%, Tris-HCl 5 mM, pH 7,4). Si la concentration en NaCl est même un peu plus élevée que 10 mM, cela conduira à une grande quantité d'ARN restant dans la partie supérieure du gel, et l'électrophoregramme sera de mauvaise qualité.

Trois types d'ARN spécifiques au virus peuvent être extraits de la cellule: 1) ARN de virlon (ARNv); 2) ARN complémentaire de virionique (ccRNA); 3) ARN double brin (dnRNA). Il est possible d'isoler un ARNv relativement pur du complexe nucléon-protéine - ribonucléoprotéine (RNP). La méthode d'allocation sera décrite dans la section VA, 1 de ce chapitre). L'isolement de l'ARNc se produit généralement lorsque l'ARN est isolé de la préparation de polysomes, car la partie principale, si

toutes les informations virales (messager) de l'ARN (ARNm) ne sont pas des vcRNA (section VB, 1).

Plusieurs études ont décrit l'isolement à partir de cellules infectées d'ARNdn spécifique au virus (Pons, 1976b; Pons, Hirst, 1968b). La méthode d'isolement consiste à traiter les cellules infectées avec un mélange de phénol avec du SDS, puis à chromatographier l'ARN isolé sur des colonnes de cellulose CFll (Franklin, 1966) et à isoler le produit, dont 90% sont résistants au traitement à l'ARNase. L'ARN isolé par ces méthodes α, lorsqu'il a été étudié en utilisant PAAGE, a donné six fragments d'ARN spécifiques au virus bien résolus (26). La dénaturation de l'ARNdn par le diméthylsulfoxyde a conduit «à l'apparition d'ARN simple brin (ARNs) avec une mobilité électrophorétique équivalente à celle des fragments d'ARNv (Pons et Horst, 1968b).

B. ANALYSE DE L'ARN EXTRAIT

Actuellement, il existe de nombreuses méthodes pour isoler l'ARN viral des cellules et virions infectés. Le choix de telle ou telle méthode est dicté dans une large mesure par la méthodologie d'analyse des produits et le fait que ce produit sera utilisé. Cela signifie que s'il est nécessaire d'étudier l'activité biologique de l'ARN extrait, alors la présence de petites quantités de Mg2 + est souhaitable pendant le processus d'isolement. Cependant, la présence de Mg2 + dans le système conduit à l'agrégation d'ARN du virus de la grippe et, si les agrégats ne sont pas éliminés (par exemple, en ajoutant de l'EDTA) avant l'analyse, il est possible d'obtenir de fausses données lors de l'étude d'échantillons d'ARN en utilisant la méthode de sédimentation rapide. Dans la plupart des cas, l'ARN spécifique du virus est extrait en utilisant un mélange phénol-chloroforme (1: 1) en présence de SDS (Penman, 1969) dans un tampon SLA.

1. Analyse de l'ARN extrait par centrifugation en gradient

La centrifugation à gradient rapide est la méthode la plus simple pour déterminer les paramètres de sédimentation et obtenir des informations de base sur les virions et les ARN spécifiques au virus. L'acide ribonucléique obtenu à partir de virions traités avec un mélange SDS phénol-chloroforme est remis en suspension après précipitation avec de l'alcool dans un tampon STE. L'ARN est stratifié sur un gradient linéaire (10–35%) de glycérol (volume d'un seul gradient de 17 ml) dans un tampon STE contenant 1 M d'urée (tampon STEU). Nous avons constaté que si vous couvrez un tube à centrifuger,

une fine couche de graisse silicone, cela améliore la résolution et réduit l'influence des parois lors de la centrifugation. La glycérine est utilisée dans la plupart des expériences (à l'exclusion des expériences sur l'étude des polysomes), car elle a une densité plus faible que le saccharose; contrairement au saccharose, il peut être passé à l'autoclave pour stériliser et détruire l'ARN impureté; il ne gèle pas à une température de -20 ° C, ce qui résout un certain nombre de problèmes qui surviennent lors de la congélation de matériel biologique et, enfin, la glycérine est plus faible que le saccharose, un extincteur dans la plupart des fluides de scintillation.

Après passage de l'ARN viral à travers le gradient de glycérol par centrifugation à 120 000 g pendant 17 heures, des fractions (1 ml) sont collectées à partir du fond du tube à centrifuger et la radioactivité de chaque fraction est déterminée. Comme on peut le voir sur 27, en utilisant cette technique, l'ARN peut être divisé en trois classes avec des coefficients de sédimentation d'environ 18S, 14S et 11S. Si pré-

ne traitent pas le virus viral pendant la purification de l'ARNase; quatre classes avec des coefficients de sédimentation dans la gamme de 4–7 S sont généralement observées. Il est probable que le matériau avec un coefficient de sédimentation de 7S soit l'hôte et l'ARN virion libre adsorbé à la surface du virion.

2. Analyse de l'ARN extrait par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAAGE)

Bien que l'analyse de l'ARN viral par PAAGE soit plus compliquée que son étude par sédimentation, il s'agit d'une méthode plus informative. Jusqu'à présent, deux systèmes de gel ont été principalement utilisés: un gel d'agarose-acrylamide utilisant du bisacrylamide comme copolymère (Pons et Hirst, 1968a) et un gel d'acrylamide sans agarose utilisant de l'éthyleldiacrylate (Duesberg, 1968) ) Les deux systèmes ont leurs avantages et leurs inconvénients, cependant, nous ne décrivons en détail que le premier système. Notre expérience avec le système agarose - acrylamide - bisacrylamide suggère que pour obtenir des résultats satisfaisants, plusieurs sources d'erreurs régulières doivent être exclues. Une description détaillée de la méthode elle-même est donnée dans les travaux de Pons et Hirst (1968a), ainsi que Pons (1972). Les détails importants de l'expérience, qui ont été mentionnés précédemment et qui ont été omis dans les travaux ci-dessus, comprennent: la nécessité d'obtenir des gels et une électrophorèse dans des tubes en verre recouverts d'une substance silicone, comme le diméthyl dichlorosilane; la nécessité d'enrober le gel d'une couche d'eau immédiatement après avoir mélangé les composants du gel avant la polymérisation et, enfin, l'opportunité d'introduire le colorant de départ dans la solution d'ARN analysée dans la solution. Le colorant de départ doit être placé dans un gel séparé, préparé de manière similaire au gel avec l'ARN analysé.

La figure 28 montre un électrophoregramme typique d'ARNv marqué à l'uridine PH1 isolé de v'irions.L'électrophorèse sur gel d'ARNn obtenu à partir de cellules infectées a montré la présence de six molécules d'ARN de longueur différente (voir 26) (Pons et Hirst, 1968). Selon Skehel (1971), six molécules d'ARNs différentes peuvent être obtenues en utilisant PAAGE si le virus est détruit en utilisant du lithium dodécyl sulfate. D'un autre côté, Lewandowski et al. (1971), en utilisant une autre méthode basée sur la détermination du nombre d'extrémités 3 ', nous avons estimé le nombre minimum de fragments d'ARN dans un vyarion et obtenu le nombre 7. Ainsi, maintenant, on peut probablement soutenir que

le génome du virus de la grippe est composé de 6 à 7 molécules d'ARN1 individuelles. L'incertitude dans la connaissance du nombre exact de fragments contenus dans une seule particule virale rend impossible de déterminer avec précision le poids moléculaire relatif du génome viral. Cependant, une évaluation basée sur la quantité d'informations nécessaires à la synthèse de polypeptides spécifiques au virus suggère que

le génome doit avoir un poids moléculaire d'au moins 3,5-106-4-10E. Lewandowski et al. (1971) ont déterminé que le poids moléculaire total des sept fragments d'ARN décrits par lui devait être d'au moins 4,7-107.

Récemment, nous avons utilisé un nouveau système d'électrophorèse utilisant à la place des gels cylindriques plats («gels faibles»). Cette méthode nous a permis de montrer que le génome du virus de la grippe se compose de 8 morceaux distincts d'ARNa. Lorsque l'ARNdl a été isolé de cellules infectées, 8 fragments d'ARNdn ont également été observés. Dans les deux cas, les fragments d'ARN ont été regroupés comme suit: 3 gros fragments avec un poids approximativement moléculaire, 3 fragments avec des tailles intermédiaires et des poids moléculaires très différents, et 2 fragments de petite taille. Palese, utilisant une méthode similaire pour l'analyse de l'ARN, a reçu 9 fragments d'ARN (Palese, message personnel). La présence de 9 et des fragments d'ARN suivants (ayant un poids moléculaire inférieur à celui d'autres fragments) est probablement liée à la multiplicité des infections.

L'acide ribonucléique de la grippe peut être analysé en utilisant MAK-1K0LONOK selon la méthode décrite par Mendall et Hershey (1960). Dans le mode d'élution en gradient, l'ARNv élue de ces colonnes à 1 M de NaCl (Pons, 1967a) en tant que pic séparé. Une analyse ultérieure de cet ARN pendant la séparation à l'aide d'une sédimentation à grande vitesse a montré que l'ARN sédimentait dans une large zone avec un coefficient de sédimentation moyen de 18S. Ainsi, l'utilisation de colonnes MAK pour étudier l'ARNv isolé présente des avantages limités par rapport à d'autres méthodes, cependant, cette technique est extrêmement pratique pour l'analyse d'ARN isolé à partir de cellules infectées. Une chromatographie sur une colonne MAK d'un tel ARN isolé en utilisant un mélange phénol-SDS conduit à la séparation des onARN viraux et des ARNdb. L'ARN simple brin élue avec l'ARN ribosomal 285 de la cellule hôte. Si vous essayez de séparer un tel mélange de l'ARN de la cellule hôte et du virus en utilisant une sédimentation rapide, l'ARN (ayant une constante de sédimentation moyenne de 18S) et le 28S-PHK de la cellule hôte sortiront en différentes fractions. En utilisant cette méthode, un HRIC relativement pur isolé d'une cellule peut être obtenu.

C. PROPRIÉTÉS PHYSIQUES ET CHIMIQUES DE L'ARN INFLUENZA VIRA

A. ARN DE VIRUS INFECTIEUX

Dans les sections précédentes, nous avons décrit les différentes méthodes utilisées pour isoler et analyser l'ARN des virions. À l'exception d'un ouvrage de Li et Seto (1970), qui affirmait que `` l'ARN isolé des particules virales peut être obtenu sous la forme d'une molécule de polymère distincte, visible au microscope électronique, toutes les données décrites par de nombreux auteurs indiquent que l'ARN viral fragmenté. Comme mentionné ci-dessus, il existe plusieurs opinions sur le nombre exact de fragments d'ARN qui composent une seule particule virale. Ce fait ne permet pas de déterminer avec certitude le poids moléculaire relatif du génome viral.

Duesberg et Robinson (1967) ont déterminé la composition nucléotidique de l'ARNv isolé de la souche PR8: uracile 33%, cytosine 24%, adénine 23% et guanine 19,5%. "Auparavant, Ada et Perry (1956) ont constaté que la composition nucléotidique de l'ARNv Bien qu'il ne varie que légèrement, il varie de souche en souche.La composition nucléotidique de l'ARNv, ainsi que sa sensibilité à l'ARNase, indiquent qu'il est simple brin, car l'eamogridisation entre les molécules d'ARN isolées des virpons n'est pas observée, sur l'ARN dans divers virions représentés par des chaînes de même polarité (Scholtissek, Becht, 1971; Pons, 1971).

Une propriété importante de l'ARN du virus de la grippe est sa fragmentation. Il est probable que le grand nombre de propriétés biologiques du virus qui le distinguent de la plupart des autres virus animaux peut être expliqué sur la base de ce fait. Bien que certains virus végétaux semblent avoir un génome fragmenté, il a maintenant été démontré qu'en plus du virus de la grippe, l'ARN fragmenté ne contient que des ré et oncornavirus1. Actuellement, la fragmentation du génome des virus grippaux est confirmée par des méthodes physiques, chimiques et biologiques.

L'analyse de sédimentation d'ARN marqué extrait de particules virales purifiées a conduit de nombreux chercheurs à conclure indépendamment que cet ARN a un poids moléculaire relatif trop petit pour coder les informations nécessaires à la synthèse de polypeptides spécifiques au virus (Davis et Barry, 1966; Duesberg Robinson, 1967; Nayak, 1969; Pons, 1967a). Dans les deux derniers travaux, l'isolement d'ARN à haut poids moléculaire a été décrit (Agrawal et Bruening, 1966), cependant, comme il est maintenant clair, les résultats obtenus sont probablement associés à l'agrégation de fragments d'ARN ou à la présence de molécules RNP incomplètement déprotéinisées. Une analyse de l'ARNv par Duesberg (1968), Pons et Hirst (1968a) en utilisant PAAGE a montré que le génome viral est la somme d'au moins cinq fragments d'ARN. Позже было обнаружено, что вирусспецифические донРНК, экстрагированные из инфицированных клеток, также представляют собой смесь фрагментов, которые после разделения на онРНК при плавлении имели те же электрофоретичесше подвижности, что и РНК, выделенные из вирионов (Pons, Hirst, 1968). Эти факты подтвердили точку зрения, что наличие фрагментов имеет биологическое значение и не связано с простыми деградационными процессами во время выделения РНК-

Приведенные биохимические эксперименты показали, что вирусный геном фрагментарен. Существует также несколько биологических фактов в пользу этого вывода. Высокая частота рекомбинаций, полученная при генетических скрещиваниях вирусов гриппа, указывает на наличие механизма, сходного со случайной пересортировкой сегментов, а не на процесс классической генетической рекомбинации с кроссинговерам между отдельными видами РНК (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Scholtissek и Rott (1969) обнаружили, что байер-139 (Вауег-139) инактивирует свойства вируса ступенчатым образом. Это указывает на наличие у вируса мультикомпонент-ного гнома. Опыты по множественной реактивации (Hend, Liu, 1951; Barry, 1961) и ультрафиолетовой инактивации (Joss et al., 1969; Gandi, Burke, 1970) были также интерпретированы как возможное доказательство существования мультикомпонентного генома.

Хотя данные биохимических и .биологических исследований наводили на мысль о существовании фрагментарного генома, наиболее доказательными экспериментами в пользу этого предположения были следующие: Young и Content (1971) разделили с помощью скоростной седиментации в РНК на фрагменты трех размеров. Каждый из трех классов фрагментов обладал собственным 5' концом вида рррАр. Le-wandowski и соавт. (1971) показали, что да З'-конце находится нефосфорилированный уридин (У-ОН). 'Кроме того, Content и Duesberg (1971) обнаружили разницу в последовательности оснований у трех различных по размерам классов вРНК, a Horst и соавт. (1972) показали наличие разных олигонуклеотидов в каждом из названных фрагментов РНК. Эти данные, при учете описанных ранее, позволяют сделать вывод, что крайне маловероятно, или даже невозможно, возникновение фрагментов РНК за счет расщепления одной ко-валентно непрерывной однонитчатой молекулы РНК

Таким образом, ясно, что геном вируса гриппа фрагмен-тирован. Однако нет каких-либо доказательств в пользу того, что имеет место связь между отдельными фрагментами, такая, например, как перекрывание комплементарных (концов. Поскольку вируоспецифическая РНК, -изолированная из инфицированных клеток, также фрагментирована, не совсем ясно, каким образом при созревании вируса в его состав включается нужное число нужных фрагментов РНК. Этот вопрос будет обсужден в разделе V этой главы.

Б. РНК, ИЗОЛИРОВАННАЯ ИЗ НЕПОЛНОГО (ФОН-МАГНУСОВСКОГО) ВИРУСА

Одна из особенностей вируса гриппа состоит в том, что при последовательных пассажах на куриных эмбрионах или клеточных культурах при высокой множественности заражения продуцируется сниженное количество инфекционного вируса при сохранении высокого титра гемагглютинации. Этот вирус с низкой инфекционностыо и высокой гемагглютиниру-ющей активностью называется неполным, или вирусом фон-Магнуса (von Magnus, 1954). Duesberg (1968) с помощью метода ПААГЭ обнаружил, что неполный вирус имеет сниженное содержание фрагментов РНК с большой молекулярной массой. Pons и Hirst (1969) показали, что после двух пассажей с высокой множественностью заражения в неполном вирусе резко снижается содержание только самого большого по размерам фрагмента РНК, в то время как лоллпептидный состав его меняется лишь количественно. Необходимо отметить, что хотя мы упомянули об этом самом большом по молекулярной массе фрагменте как об «утерянном» в процессе формирования неполного вируса, нельзя исключить возможность его присутствия во фрагментированном виде. Это может произойти, если РНК расщепляется в одной или большем количестве точек цепи. РНК в этом случае будет присутствовать в вирионе, но будет мигрировать в полпак-риламидном геле в новом месте, а это может привести к заключению об отсутствии фрагмента в вирусном препарате. Однако в настоящее время нет экспериментального доказательства этой точки зрения.

Choppin (1969) обнаружил, что несколько последовательных пассажей вируса гриппа штамма WSN с высокой множественностью заражения на клетках MDBK не приводят к образованию заметных количеств неполного вируса. С другой стороны, один пассаж этого вируса на клетках HeLa приводит к продукции неинфекционных НА-частиц (Henle et al., 1955; Hillis et al., 1960; White et al., 1965; Ter Meulen, Love, 1967). Choppin и Pons (1970) исследовали РНК вирусов, выращенных на клетках MDBK и HeLa, и обнаружили,,

что для вируса, выращенного на клетках MDBK, наблюдалось лишь небольшое снижение количества самого большого по размерам фрагмента РНК, и только после четырех последовательных пассажей с высокой множественностью заражения его количество снижалось в значительной степени (в отличие от двух пассажей на куриных эмбрионах и монослоях клеток CEF). В клетках HeLa одного пассажа вируса, культивированного ранее на .куриных эмбрионах, было достаточно для элиминирования самого 'высокомолекулярного фрагмента РНК. Larner и Hodge (1969) определили, что в клетках HeLa, инфицированных вирусом гриппа штамма PR8, синтезируются все семь фрагментов днРНК. Однако эти авторы не анализировали состав онРНК неполных вирусных частиц.

Описанные результаты указывают на то, что клетка-хозяин играет значительную роль в репликации вирусной РНК, хотя природа этого влияния еще неизвестна. Неясен также механизм, согласно которому отдельный фрагмент РНК элиминируется из вириона, хотя и было предложено следующее объяснение этого явления (Choppin, Pons, 1970). Поскольку репликация меньших по относительной молекулярной массе фрагментов РНК заканчивается раньше, чем репликация больших фрагментов (Mills et al., 1967; Spigelman et al., 1968), избыточное количество частиц вируса гриппа в клетке может привести к истощению пула нуклеотидов или другого химического соединения (других химических соединений), необходимого для синтеза больших по размерам молекул РНК- Эта гипотеза о конкурентной репликации малых фрагментов РНК исходит из предположения о независимости синтеза каждого отдельного фрагмента от синтеза других фрагментов, а также из случайного процесса упаковки фрагментов РНК в вирион (Compans et al., 1970). С тех пор как эта гипотеза была сформулирована, Bishop и соавт. (1972) показали, что каждый фрагмент РНК несет на себе свою собственную молекулу полимеразы. Это явилось аргументом в пользу описанного механизма.

IV. КОМПЛЕКС РНК С БЕЛКОМ (РНП) А. ФИЗИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

При разрушении вирионов гриппа с помощью эфира (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Davenport et al., 1959), дезоксихолата натрия (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969) или нонидета P40 (NP40) (Ponsetal., 1969) высвобождается стабильный комплекс РНК с белком. Этот нуклеопро-теид (РНП) содержит 10% РНК и 90% белка. Белковая компонента РНП имеет относительную молекулярную массу

около 55 000—65 000 и обозначается символом NP (Pons et al., 1969). Скоростное градиентное центрифугирование РНП в 10—35% глицериновом градиенте с 'использованием буфера STEU позволяет разделить РНП на три типа молекулярных комплексов со средними коэффициентами седиментации 48, 40 и 34S (Pons, 1971). Duesberg (1969), а также Kingsbury и Webster (1969) тоже изолировали три класса различных по размерам РНП, но с более высокими значениями коэффициентов седиментации—приблизительно 70, 60 и 50S. Разница в приведенных значениях коэффициентов седиментации, вероятно, связана с различием методов изоляции и анализа РНП, который имеет тенденцию IK агрегации в отсутствие мочевины или в растворах с низкой концентрацией солей. После фиксации РНП с помощью глютаральдегида его плавучая плотность в хлориде цезия равна 1,34 г/см3 (Krug, 1971).

Pons (1971), используя анализ изолированного РНП с помощью ПААГЭ, доказал предположение Duesberg (3969), Kingsbury и Webster (1969) о том, что каждый из различных по относительной 'молекулярной массе фрагментов РНП, изолированных с помощью центрифугирования в градиенте плотности, представляет собой комплекс разных по размерам молекул РНК с белком NP. В настоящее врехмя нет доказательств существования единой цепочки РНП (структура, в которой фрагменты РНК удерживаются на непрерывной цепи субъединиц NP) как в вирмоне, так и в инфицированной клетке.

В отличие от РНП парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1967) РНП вируса гриппа чувствителен к действию РНК-азы (Duesberg, 1969; Pons et al., 1969). Обработка РНП проказой приводит к расщеплению -белка NP и к высвобождению вирусной РНК (Pons et al., 1969). Мяша(я обработка проназой не вызывает деградации белка NP (Duesberg, 1969). Приведенные экспериментальные данные указывают на стериче-окую доступность как 'белка, так и РНК, входящих в РНП-комплекс, хотя каждая из составных частей РНП и экранирует связанную с ней макромолекулу.

Pons и соавт. (1969) провели электронно-микроскопическое изучение изолированного РНП, оттеняя его с помощью укранилацетата или негативно контрастируя его фосфоволь-фраматом калия. Наблюдаемые структуры имели спиральные или окрученные торцовые сечения с противоположио направленными глубокой и мелкой бороздками и с петлями на каждом из концов. Эти структуры -были различной длины: в пределах от 50 до 150 нм и постоянной толщины: 15 ям (7,5 нм для концевых петель) (Schuize et al., 1970) (29, A). Corn-pans и соавт. (1972) получили аналогичные результаты и показали, что длина каждого из фрагментов РНП отражает

длину молекулы РНК, входящей в его состав. Морфологически РНП представляет собой комплекс, состоящий из РНК и белка, закрученный сам на себя с образованием высоко-спиральной структуры, причем ни РНК, ни белок не являются чехлом для другой макромолекулы, входящей в состав рибонуклеопротеида.

Scholtissek и Becht (1971) показали, что белок NP имеет одинаковое сродство к вРНК и >к вкРНК- Он также присоединялся к клеточным РНК, содержащим в большом количестве АМФ, и к другим одноцепо'чечным РНК. С двунитчаты-ми РНК белок не взаимодействовал. Как 'было указано, РН'П-комплеке стабилен в 1 М мочевине, а также в 0,8 М Nad или в 1 М КС1. В условиях in vitro, по-видимому, нет высокой специфичности во взаимодействии между молекулами белка NP и РНК- Другого рода указание о потере специфичности 'было проведено в исследованиях Pons и соавт.(1969), Goldstein и Pons (1970). Как показали эти авторы поливинилсульфат (PVS) вытесняет РНК с белкового остова, что -приводит к возникновению комплекса PVS-NP, который имел седиментационные свойства и морфологию, сходную с исходным РНП (29,.6). Свободная вирусная РНК, се-диментирующая при 18S, была чувствительна к расщеплению РНК-азой, как это наблюдается для РНК, выделенной с помощью фенольного метода, в то время как комплекс PVS-NP был нечувствителен к действию РНК-азы. Результаты описанных экспериментов указывают на то, что морфология РНП в основном определяется взаимодействием между молекулами NP. Действительно, комплекс имеет сходную структуру вне зависимости от того, связывается ли молекулуа NP с РНК или с резко отличной от нее (Молекулой PVS. Кроме того, .комплекс PVS-NP, идентичный физически и морфологически РНП, может быть получен только в случае, когда PVS добавляется к ннтактному РНП. Добавление PVS к свободным субъединицам NP приводит к возникновению гетерогенной смеси молекул (комплекса PVS-белок, который не сходен с РНП ни в еедиментационном, ни в морфологическом отношении. Взаимодействие PVS с РНП также указывает на то, что, как .было отмечено Schulze (1973), в формировании РНП играют роль в основном зарядовые взаимодействия между молекулами белка и фоофоэфиряого остова РНК, поскольку РНК может быть заменена полимером, содержащим в своем составе заряженные фосфатные группы.

Для изоляции РНП из инфицированных клеток 'было разработано несколько различных методов (Pons, 1971, 1972).
При использовании любого из них выделялся РНП, плавучая плотность, коэффициент седиментации и морфологические характеристики которого были идентичны характеристикам ви-рионного РНП. Имелось только одно различие между РНП, выделенными из вирионов и из инфицированных клеток: ви-рионный РНП состоял из белка, находящегося в комплексе только с вРНК, в то время как 90% клеточного РНП содержало вРНК, а 10% — BIKPIHK. В отличие от Krug (1972), который обнаружил свободную BIKPHK В инфицированных .клетках, мы не обнаружили свободной вирусспецифической РНК в клетке (кроме днРНК). Наш метод выделения давал нам всю внутриклеточную вирусспецифичеокую РНК в виде РНП. Причины приведенного различия в результатах пока неясны.

Б. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНП

До сих пор нет доказательства того, что белковая часть РНП играет какую-либо другую роль, кроме осуществления функции защитного чехла для РНК. Возможно, что сегменты

РНК могут быть связаны в единую цепь на непрерывном остове NP-белка. Хотя такого рода структура и не обнаруживалась, тем не менее была предложена модель репликации РНК, предполагающая ее существование (Pons, 1970). Кроме того, белок NP или сам РНП может обладать некоторой регуляторной функцией при транскрипции, трансляции или репликации. Ответы на эти вопросы могут быть найдены в процессе изучения транскрипции и трансляции в системе in vitro.

Hir'st и Pons (1972) обнаружили, что вирусные экстракты, содержащие РНП штамма вируса гриппа дикого типа (WSN), имели более высокую восстанавливающую активность (marker rescue) в опытах с температурочувствительны-ми мутантами. Природа и строение вещества, вызывающего эффект .восстановления, неясна, однако свободная вирусная* РНК, выделенная из вирионного РНП с помощью смеси фенол—SDS или при обработке его лолививидеульфатом, была: полностью неактивна в этом отношении. Существенно ли для: восстановительных свойств препарата присутствие в системе: только белка NP или смеси этого белка с полимеразой — еще не ясно.

V. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИЕ РНК

А. ВИРИОННАЯ РНК

1. Синтез вРНК

Несмотря на то что до настоящего времени было выполнено большое число работ, посвященных изучению синтеза РНК 'вируса гриппа в клетке-хозяине, интерпретация их результатов была осложнена в результате того, что вирусная репликация ингибировалась в присутствии актиномицина D (AD). Некоторые авторы (интерпретируют свои результаты, считая, что синтез вирусной РНК становится нечувствительным к AD спустя 2—27г ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964; Kingsbury, 1970; Blair, Duesberg, 1970). Тем не менее имеется другая точка зрения, согласно которой AD обладает ингибирующим действием вне зависимости от времени его введения в систему (Scholtissek, Rott, 1970; Gregoriades, 1970; Pons, 1973). Эти работы будут подробно обсуждены в разделе VIA. Мы: подняли здесь этот вопрос только для того, чтобы подчеркнуть тот факт, что исследования, о которых будет сказано далее, в основном были выполнены без применения каких-либо ингибиторов синтеза вирусной РНК и в связи с этим потребовали значительных усилий для разделения вирусспепифических продуктов и продуктов клетки-хозяина в процессе созревания вируса.

Как указывалось в разделе ПВ, 1 вирусспецифические РНК имеют среднее значение 'коэффициента седиментации, равное 18S. Рибоеомалыные РНК клеток-хозяев млекопитающих седиментируют при 28 и 18S. Таким образом, при использовании ингибиторов синтеза рибосомальной РНК клетки-хозяина трудно сделать какие-либо заключения о синтезе вирусной РНК. в связи с тем, что 18S РНК входит в состав как вируса, так и клепки-хозяина. Для преодоления этой трудности был разработан метод выделения из клетки вирусных РНК в виде РНП. Р'ибонуклеопротеид имеет средний коэффициент седиментации 30—50S, стабилен в присутствии ЭДТА, высоких концентраций солей и мочевины (эти виды обработки разрушают рибосомы клетки-хозяина) и может быть сконцентрирован осаждением в изоэлектрической точке (Schafer, Munk, 1952). Используя эти свойства РНП, для его изоляции инфицированные клетки разрушают с помощью NP-40, РНП извлекают и концентрируют с помощью преципитации в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и очищают скоростным центрифугированием 1—2 раза через глицериновый градиент (Pons, 1971). Изолированный и очищенный таким способом РНП имеет плавучую плотность, седиментационные характеристики и морфологию вирионного РНП. Однако в то время как вРНК не обладает способностью ж самогибридизации, до 20% РНК, выделенной из внутриклеточного РНП, самогибридизуется. Эти данные совместно с данными конкурентной самогибридизации указывают на то, что внутриклеточный РНП содержит 90% вРНК и 10% вкРНК (Pons, 1971).

Scholtissek и соавт. (1969) сообщили, что синтез вирусной РНК связан с синтезом полипептида NP. Этот факт позволяет изучать кинетику синтеза вирусной РНК по возникновению в клетке РНП. Кроме того, использование методов, разработанных для изучения внутриклеточного синтеза в процессе клеточной репликации, 'позволило высказать точку зрения, что в клетке нет свободных вируослецифических РНК (Pons, 1971, 1972). Это означает, что, как только происходит синтез цепи РНК (или даже во время самого синтеза), она ассоциируется с молекулами 'белка NP. Krug (1971), однако, интерпретировал полученные им данные на основе .предположения о том, что синтез вкРНК происходит намного раньше, чем образование вкРНП. Несмотря на это несоответствие точек зрения, по-видимому, все же правомочно рассматривать синтез РНП в качестве критерия синтеза РНК. Pons (1971) показал, что РНП можно обнаружить уже через 1 ч после начала инфекции. Ранее было обнаружено, что вирус-специфическая днРНК может быть, найдена в клетке спустя

'/г ч после начала инфекции (Pons, 1967b). Это различие можно объяснить просто методологическими трудностями экстраполяции кривой синтеза РНП в начальной точке отсчета времени. Кинетика синтеза РНП имеет все черты, характерные для синтеза самореплицирующихся молекул (Pons, 1971).

В заключение следует отметить, что полученные данные указывают на то, что синтез вирусной РНК, наблюдаемый по возникновению РНП, начинается почти сразу же после начала инфекции. Асимптотическое поведение кривой кинетики накопления РНП указывает на наличие самодуллицирующихся молекул. В случае использования монослоев клеток куриных фибробластов синтез РНП начинается максимум через 4—5 ч после инфекции, когда во внеклеточной жидкости обнаруживаются вновь синтезированные вирусные частицы, и некоторые кленки деградируют. Другой аспект проблемы внутриклеточного синтеза вирусной РНК состоит в том, где синтезируется эта РНК- Этот вопрос будет рассмотрен в гл. 8.

2, Созревание и упаковка РНК в вирионы

Механизм, согласно которому РНК (или РНП) упаковывается в вирусную частицу, до настоящего времени неизвестен. Ясно, что имеет место процесс отбора, в результате которого во вновь формируемые вирусные частицы включаются только РНП, содержащие молекулы вРНК (но не вкРНК). Можно предположить, хотя в настоящее время и нет прямых доказательств этого утверждения, что на ранних этапах созревания вирионов в сборке участвуют какие-то полимерные молекулы (вероятно, .молекулы М-белка), содержащие места для «узнавания» вРНК- Если такой инициатор-ный механизм имеет место, то молекулы других полипептидов или субъединицы того же белка конденсируются вокруг РНП и начинается процесс самосборки, который заканчивается отпочкованием цельных вирусных частиц от тех специфических участков клеточных мембран, которые ранее претерпели изменения и содержат вирусные компоненты.

Выяснение вопроса о том, как полный набор фрагментов вирусной PiHK (в виде РНП) упаковывается в отдельную1 вирусную частицу,—сложная задача, особенно при учете фрагментарности вирусного генома. Хотя мы и не можем исключить возможность «выстраивания» фрагментов РНК или связывания их упорядоченным образом на непрерывном белковом остове, в настоящее время нет достаточных доказательств этого утверждения. Compans и соавт. (1970) рассчитали, что если для формирования полного вирусного генома требуется 5 фрагментов и если в действительности упаковывается случайным образом 7 фрагментов, около 22% вирусных частиц будут содержать полный набор из пяти необхо-

димых фрагментов РНП. В настоящее -время обнаружено, что в каждом вирионе содержится по .крайней мере шесть или семь фрагментов. Таким образом, если признать правильной приведенную схему, необходимо предположить, что в процессе упаковки в каждую вирусную частицу должно лопасть 9—10 фрагментов РНП. Хотя это и немного завышенная величина, если основываться на данных химического анализа содержания РНК в одной вирусной частице, эту возможность нельзя исключить. Такой механизм созревания вместе со способностью вирионов ж агрегации и увеличения за счет этого своей инфекционное™ (Hirst, Pons, 1973) дает вирусу гриппа преимущества в борьбе за существование в природе. Один экспериментальный подход к данному вопросу крайне полезен, но на практике он очень сложен в техническом отношении. Если предположить, что репликация фрагментов РНП осуществляется случайно, можно ожидать следующее. Случайный, или неупорядоченный, синтез фрагментов РНП должен привести к избыточной продукции меньших по размерам фрагментов. Это предположение основано на том, что молекула полимеразы каждого фрагмента РНП (Bishop et al., 1972) реплицирует РНК с одинаковой скоростью. Вследствие этого самый маленький по размерам фрагмент РНП, длина (которого составляет 7з длины наибольшего из фрагментов, будет реплицироваться в 3 раза большем количестве. Полученные нами данные не подтверждают это предположение Bishop и соавт. (1972). Соотношение между количеством разных фрагментов 'было равно 2:1:1:1:2 — от самого .большого по размерам фрагмента к самому малому (Pons, неопубликованные данные). Отсюда можно сделать вывод, что, хотя яри формировании зрелых вирионов фрагменты вирусспецифических РНК « могут включаться в вирусную частицу случайно, их репликация или транскрипция каким-то образом регулируется или контролируется. Если включение фрагментов РНП в вирлон подчиняется законам случайных процессов, то их относительное распределение должно быть одинаковым как при выделении из вирионов, так и при изоляции из внутриклеточного пула. Предварительно полученные данные были неоднозначны в связи с большими техническими трудностями при постановке опытов, заключающимися в присутствии в популяции неполного вируса и отсутствии синхронности инфекционного процесса в разных клетках.

Б. КОМПЛЕМЕНТАРНАЯ ИЛИ ИНФОРМАЦИОННАЯ РНК {вкРНК)

1. Внутриклеточная локализация вкРНК

Было показано, что РНК, комплементарная вРНК, ассоциирована в инфицированных клетках с полисомами (Pons, 1972). Установлено (см. раздел Va, 1), что 10% внутриклеточ-

ной вирусспецифичеокой РНК, изолируемой в виде РНП, представляет собой вкРНК. Однако после фракционирования клеток было обнаружено, что большая часть вирусспецифи-ческой РНК, ассоциированной с лолиоомами, была представлена вкРНК (Pons, 1972). Недавно Etkind и Krug (1974) сообщили, что вся полиеомная РНК представляет собой вкРНК. Этот вывод не согласуется с нашими данными, поскольку в нашей работе мы вынуждены были использовать коррекцию для учета вклада РНК клетки-хозяина. Etkind м Krug (1974) провели тщательное удаление всех контамини-рующих РНК клетки. По-видимому, вирус гриппа .подобен другим вирусам, содержащим в составе своих вирионов РНК-зависимую PiHK-лолимеразу (например, вирус везикулярного стоматита), и в связи с этим способен к синтезу функциональной информационной РНК через короткое время после начала инфекционного процесса.

Другого рода экспериментальный подход позволил полу

чить данные, интерпретация (Которых может привести к за

ключению о том, что природа информационной РНК отлична

от той, о которой говорилось ранее. Эти данные крайне про

тиворечивы н в настоящее время могут рассматриваться

лишь как предварительные. Siegert и соавт. (1973) сообщили

о синтезе полипептида NP в Е. coli бесклеточной белоксинте-

зирующей системе при использовании в качестве информа

ционной РНК 'вРНК. Kingsbury и Webster (1973) получили

прямо противоположные результаты, обнаружив, что вРНК

не может выступать в качестве информационной в бесклеточ

ной системе ретикулоцитов кролика. (В то же время, по их

данным, РНК, изолированная из инфицированных клеток

(смесь вРНК и вкРНК), выступала как иРНК, и ее присутст

вие в системе приводило к синтезу М-белка. На основе этих

прямо противоположных результатов трудно выработать (ком

промиссную точку зрения, однако, учитывая предварительный

характер сообщений, до появления результатов, подтвержда

ющих тот или иной результат, можно с осторожностью пред

положить, что один из фрагментов вРНК -может выступать

в качестве информационной РНК. Данные по самогибриди

зации, полученные Etkind и Krug (1974), а также Pons

(1972), исключают наличие 'больше чем одного фрагмента

вРНК, служащего матрицей как в транскрипции, так и в

трансляции.

2. Кинетика синтеза вкРНК

Работы по изучению синтеза РНП и днРНК, описанные

ранее, показали, что синтез вкРНК начинается очень скоро

*после начала инфекции. Более объективное изучение синтеза

именно этого типа РНК может быть проведено путем иссле-

давания появления вкРНК на полисомах. Клеши метят в течение короткого интервала пульсовой меткой [3Н]-уридином в различные моменты после начала инфекции, и полисомы выделяют и анализируют .после экстракции с помощью смеси фенолхлороформ— SDS. Полученные результаты показали, что после начального периода угнетения формирования полисом клеток-хозяев синтез вкРНК непрерывно растет. Основное количество вкРНК синтезируется через 2'/г—3 ч после начала инфекции, после чего скорость ее синтеза снижается (Pons, в печати). Аналогичные данные привели Krug и Et-kind (1973), изучавшие синтез РНК :в цитоплазме и ядрах инфицированных клеток. Эти авторы показали, что синтез вкРНК заканчивается через 4 ч после начала инфекции. Таким образом, приведенные данные указывают на то, что синтез вкРНК начинается сразу же после начала инфекции и заканчивается через 4 ч. Спустя это время вновь синтезированные вирусные частицы обнаруживаются вне клетки. Природа такого «отсекающего» механизма в настоящее время неизвестна.

3. Физические свойства информационной РНК (мРНК)

При изучении вкРНК, ассоциированной с полисомами (мРНК), обнаружено, что основное количество, если не вся мРНК, находится >в виде РНП. Полисомы изолировали, разрушали высокой концентрацией соли, ЭДТА и пуромицина (Blobel, 1971), и полученную таким образом мРНК подвергали анализу. Менее 2% вкРНК находилось в свободном виде, оставшиеся 98% составлял РНП. Большие предосторожности были приняты для того, чтобы убедиться, что полипептид NP (единственный яолипептид, ассоциированный с изолированной мРНК) неспецифически не адсорбируется на свободную мРНК в процессе самой изоляции. Трудно убедиться в том, что мРНП представляет собой «непрерывный» РНП, т. е. не имеет участков, свободных от белка, однако, основываясь на седикентационных характеристиках изолированного мРНП и его плавучей плотности в CsCl, можно сделать вывод, что, по-видимому, по своим физическим свойствам мРНП идентичен вирионному.

Большое число исследователей высказывали точку зрения, что мРНК млекопитающих существует и функционирует как иРНК в виде РНП (Spirin, Nemer, 1965; Spirin, 1966; Perry, Kelley, 1968; Henshaw, 1968; Kumar, Lindber, 1972; Bryan, Hayashi, 1973; Gross, 1968; Spirin, 1969). Ясно, что мРНП, будучи более устойчивым к расщепляющему действию РНК-аз, будет более стабилен, чем свободная мРНК. Однако не совсем ясно, как транслируется такая молекула. По-видимому, этот процесс должен включать диссоциацию субъединиц по-

липелтида с РНК в месте контакта рибосомы с мРНК. Возможно также, что полипептидная часть комплекса играет ре-гуляторную роль в процессе трансляции. Полное решение всех этих проблем будет возможно лишь при исследовании белоксинтезирующих систем.

VI. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ НА СИНТЕЗ РНК

Л. АКТИНОМИЦИН D

Ранее мы уже указывали (см. раздел1 VA, 1), что AD полностью ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от того, на каком этапе репликативного цикла он вводится в систему, и лишь в малой степени подавляет синтез вРНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). По данным Gregoriades (1970), вкРНК, синтезированная до начала ингибирования ее синтеза, продолжает функционировать как иРНК в течение по крайней мере 17 ч после добавления AD. Как установлено в настоящее время, по-видимому, интерпретация данных была прямо противоположна у исследователей, стоящих на точке зрения, что AD вообще не обладает ингибиторными свойствами, если его добавляют спустя 2—3 ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964), и тех, кто считает AD способным обладать ингибитор-ным эффектом при добавлении его в любое время (Pons, 1967b; Scholtissek, Rott, 1970). Истина, вероятно, лежит где-то между этими двумя точками зрения. Актиномицин D ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от момента появления его в клетке, в частности, если AD добавляют до момента, когда в клетке уже синтезировалось большое число молекул мРНК- Именно это является причиной снижения скорости синтеза вирусных полипептидов. Если же AD добавляют после того, как уже синтезировалось значительное количество молекул вкРНК, и этого количества достаточно для производства полипелтидных молекул и для того, чтобы на них, как на матрице, синтезировались молекулы вРНК, то синтез вирусных частиц будет проходить с нормальной скоростью.

Таким образом, начиная с этого момента, AD проявляет себя как безингибиторное вещество. Необходимо подчеркнуть, однако, что AD является ингибитором синтеза вкРНК и должен использоваться с осторожностью при изучении синтеза внутриклеточных макромолекул.

Природа ингибиторного действия AD на синтез IBKPHK В настоящее время неясна, поскольку AD эффективен при введении в «летку до начала инфекции. Вполне возможно, что AD подавляет какой-то клеточный механизм, необходимый для синтеза вкРНК. Это означает, что функциональная хозяйская ДНК, но не ее синтез (Burry, 1964), необходима для

репродукции вируса. AD не ингибирует синтез вкРНК in vitro (Chow, Simpson, 1971), во, как ни странно,, подавляет внутриклеточную транскрипцию (Bean, Simpson, 1973). Можно сделать вывод, что AD ингибирует синтез какого-то клеточного фактора (или факторов), необходимого для процесса транскрипции. Этот фактор отсутствует в системе in vitro, и, хотя некоторый синтез вкРНК и происходит, этот процесс может в значительной мере стимулироваться добавлением клеточного фактора (Rochovansky, персональное сообщение).

Работе по исследованию синтеза РНК вируса гриппа мешала невозможность провести эксперименты лульс-чейза на монослоях клеток куриных фибробластов; клетки продолжали включать меченый уридин даже в присутствии большого избытка немеченого нуклеинового основания. Недавно AD использовали для блокировки включения меченого уридина в вкРНК, ассоциированную с полисомами. Хотя это не 'был «чейз» в правильном значении этого слова, такая обработка позволила проследить судьбу предсуществующей вкРНК. Было показано, что после того, (как вкРНК 'была изолирована из инфицированных клеток после короткой пульсовой экспозиции (30 мин) меченым основанием, большая часть РНК седиментиро'вала в области 14S. При увеличении времени экспозиции коэффициент седиментации увеличивался, пока при экспозиции Р/г ч не достигал средней величины 18S и распределения, характерного для вРНК-

При обработке клеток пульсовой меткой в течение 30 мин и добавлении затем AD в разное время при отсутствии метки был показан некоторый сдвиг в распределении меченой РНК при ее скоростном седиментационном анализе. Непосредственно после действия метки приблизительно 70% меченой вкРНК наблюдали в области 9—15S и 30% —в области 15—• 22S (РНК, экстрагированная из вирионов, имела следующее распределение: 20% в области 9—15S и 80% в области 15— 22S). В конце 30-минутного периода экспозиции меткой изотоп убирали, добавляли AD и аликвоты суспензии клеток отбирали каждые 30 мин. После 60-минутной экспозиции с AD (при увеличении экспозиции дальнейших изменений не наблюдалось) метка распределялась следующим образом: 40% в области 9—15S и 60% в области 15—22S; эти величины находятся между величинами, характерными для вРНК и вкРНК в конце 30-минутного действия пульсовой метки. Важно то, что значительное увеличение включенной метки в 15— 22S РНК не обусловлено увеличением количества этой РНК, а связано с уменьшением количества 9—15S РНК- Эти результаты могут быть интерпретированы с учетом того, что AD, как и было ранее предположено, ингибирует синтез вкРНК. Однако уменьшение количества меньших по размерам фрагментов вкРНК может означать не то, что РНК яа-

ходятся в избыточном количестве, а скорее то, что имеет место наличие неполных молекул РНК большой молекулярной массы. При прекращении их синтеза с помощью AD эти находящиеся в состоянии роста молекулы диссоциируют с полисом, а в ассоциированном с полисомами состоянии остаются только закончившие свой синтез молекулы вкРНК, и они имеют то же относительное распределение по РНК-фрагментам, что и РНК, изолированная из вирионов.

Эти эксперименты были описаны здесь так -подробно для того, чтобы прояснить несколько важных для синтеза вкРНК фактов, ©o-первых, неравномерное распределение молекул вкРНК после относительно короткой пульсовой экспозиции меткой обусловлено скорее присутствием незакончивших свой синтез молекул РНК, а не избыточным содержанием малых по размерам молекул. Как уже было отмечено в разделе VA, 2, если редуллицирование вкРНК случайно и неконтролируемо, то можно обнаружить гораздо больше малых, чем больших, фрагментов РНК- Поскольку такал ситуация не наблюдается IB эксперименте, должен иметь место механизм контроля, определяющий количество синтезирующихся фрагментов данного размера. Во-вторых, поскольку были обнаружены неполностью закончившие свой синтез молекулы РНК (в виде РНП), ассоциированные с полисомами, либо транскрипция вкРНК происходит на цепочке субъединиц полипептида NP, либо этот белок ассоциирует с еще неполной цепью РНК- Этот механизм отличен от механизма, согласно которому сначала синтезируется полная молекула РНК, а затем она лротеинизируетея. Кроме того, в связи с тем что эти неполные молекулы отделяются от полисом, можно заключить, что трансляция вкРНК имеет место в то время, когда цепь еще синтезируется. Такая ситуация наблюдается в большинстве исследованных бактериальных систем.

Б. ЦИКЛОГЕКСИМИД

Циклогексимид ингибирует синтез белков за счет прекращения удлинения полипептидной цепи (Wettstein et al., 1964; Stanners, 1966; Watanabe et al., 1967). Обработка клеток, инфицированных вирусом гриппа, циклогексимидом снижает синтез вкРНК и полностью блокирует синтез вРНК (Pons, 1973). Эти результаты согласуются с результатами Scholtis-sek и Rott (1970), изучающих суммарные клеточные экстракты с помощью метода самогибридизации.

Природа ингибиторного эффекта циклогексимида еще неясна. Различная чувствительность синтеза вРНК и синтеза вкРНК к действию циклогексимида и AD указывает на то, что в синтезе принимают участие два различных фермента (или если не два фермента, то одна ферментная система с

различными субъединицами, которые могут быть представлены •поляпептвдами как клетки-хозяина, так и вирусспеци-фичеакими), синтез которых чувствителен к присутствию указанных ингибиторов.

В. КОРДИСЕПИН

Кордисепин, являясь ингибитором синтеза лоли-А последовательности (Penman et al., 1970; Darnell et al., 1971), может играть, как 'было установлено на большом числе вирусных и клеточных систем, важную роль IB синтезе функциональных информационных РНК- Клетки (CEF или ВНК-21) инфицировали вирусом гриппа, обрабатывали кордиселином в течение 45 мин в промежутке между 2 и 4 ч после начала инфекции, а затем метили [3Н]-уридином в течение 30 мин. Из клеток акстрагировали полисомы и РНП и сравнивали с полисомами и РНП необработанных инфицированных и контрольных клеток. В инфицированных клетках кордисепин вызывал 70% ингибирование включения метки как в полисо-мы, так и в РНП и 60% ингибирование титра гемаотлютина-ции и выхода инфекционного вируса. Включение метки в полисомы неинфицированных клеток CEF ингабировалось приблизительно на 80%. В клепках ВНК-21 кордисепин не влиял на титр гемагглютинации и инфекционность вируса, ингиби-ровал синтез полисом и РНП лишь в малой степени, однако ингибировал включение метки в полисомы неинфицированных клеток на 86% (Rochovansky, Pons, 1975).

По данным Etkin и Krug (1974), в мРНК вируса гриппа присутствуют лоли-А участки. Поскольку вРНК не содержит в своем составе комплементарных поли-У фрагментов (Marshall, Gallespie, 1972; Rochovansky, Pons, 1975), участок лоли-А, обнаруживаемый в молекуле вкРНК, должен присоединяться уже после окончания процесса транскрипции. Ясно, что клетки CEF, которые обладают относительно невысокой метаболической активностью, при наших условиях эксперимента [но которые более активны в системе Mahy и соавт. (1973), где кордисепин слабо влияет на продуцирование ви-рионов штамма FPV в клетках CEF] могут быть вынуждены синтезировать некоторые клеточные структуры, такие, как лоли-А, прежде чем продолжить вирусную репликацию. Клетки же ВНК-21 более активны в метаболическом отношении и поэтому могут содержать'более обширный резервуар компонентов клеток-хозяев, необходимых для синтеза вируса. Утверждение о том, что в некоторых случаях синтез клеток требуется для продукции вируса, подтверждается данными работы Mahy и соавт. (1972), в которой показано стимулирование синтеза вируса FPV в клетке CEF ДНК-зависимой РНК-полимеразой П. РНК-полимераза II является ферментом, участвующим в синтезе клеточной мРНК-

VII. CONCLUSION

Из приведенного 'Обсуждения химических, биологических и морфологических свойств РНК и РНП вирионов гриппа ясно, что геном этого вируса состоит из нескольких фрагментов однонитчатой РНК. Анализ концевых групп различных фрагментов РНК и наличие в составе каждого фрагмента молекул полимеразы делает вполне .вероятной индивидуальную репликацию каждого фрагмента. Однако менее ясен вопрос, как нужное число фрагментов нужного типа упаковывается при формировании инфекционной вирусной частицы. Находится ли процесс отбора фрагментов под контролем какого-то регуляторного механизма или происходит случайно? За счет чего в процессе этого отбора исключается молекула вкРНК? Ответы на эти вопросы ищут в настоящее время в нескольких лабораториях.

С этими проблема1ми связаны также вопросы регуляции транскрипции, трансляции и репликации РНК в инфицированных вирусом клетках. Об этих процессах известно очень мало, хотя они и являются объектом 'Многих исследований. Некоторые ответы на поднятые здесь вопросы будут, по всей вероятности, получены при использовании in' vitro РНК- и белоксинтезирующих систем.



LITTÉRATURE

Ada GL, Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1954, v. 32, p. 453.

Ada GL, Perry BTJ gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Agrawal HO, Bruening G. Proc. nat. Acad Sci. US; 1966, v. 55, p. 818. Barry RD Virology, 1961, v. 14, p. 398.

Barry RD Cell. biol. Myxovirus Infect., Ciba Found. Symp., 1964, p. SIBarry RD, Ives DR, Cruickshank JG Nature (London), 1962

Bean WJ, Simpson RW Virology, 1973, v, 56, p. 646. Bishop DH, Roy P., Bean WJ, Jr., Simpson RWJ Virol., 1972

Blair С D., Duesberg PH Ann, rev. Microbiol., 1970, v. 24, p. 539. Blobel G. Proc. nat. Acad Sci. US, 1971, v. 68, p. 832.

Bryan RN. Hayashi M. Nature (London), New Biol., 1973, v. 244, p. 271. Burnet FM, Science, 1956, v. 123, p. 1101. Choppin PW Virology, 1969, v. 39, p. 130. Choppin PW, Pons MW Virology, 1970, v. 42, p. 603. Chow N.. Simpson RW Proc. nat. Acad Sci. US, 1971, v. 68, p. 752. Compans RW, Choppin PW Proc. nat. Acad Sci. US, 1967

Compans RW, Content J., Duesberg PHJ Virol., 1972, v. 10,' p. 795. Compans RW, Dimmock NJ, Meier-Ewert H. In: The Biology of Large

RNA Viruses (RD Barry and BWJ Mahy, eds.), New York, Acad.

Content J., Duesberg PHJ mol. Biol., 1971, v. 62, p. 273. Darnell JE, Philipson, L., Wall R., Adesnik M. Science, 1971,. v. 174
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа

  1. Annexe 4 Grippe causée par le virus de la grippe A (H5N1) (grippe aviaire)
    La grippe aviaire est une infection virale hautement contagieuse qui peut toucher toutes les espèces d'oiseaux. Parmi les espèces domestiques, les dindes et les poulets sont les plus sensibles. Les oiseaux sauvages peuvent transmettre l'infection. Le réservoir naturel des virus de l'influenza aviaire (AIV) est la sauvagine, qui est le plus souvent responsable de l'introduction de l'infection dans les ménages. L'étiologie. AHP appartient à
  2. Kilburn ED. Virus grippaux et grippe (1978), 1978
    Le livre est consacré à une revue d'une variété de virus grippaux, leur culture, leur biochimie et leurs caractéristiques moléculaires. Contenu: Grippe et virus grippaux. La structure du virus de la grippe. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase. Activité de transcriptase dans les cellules et les virions de la grippe. Virus Ribonucleic Acids
  3. La culture des virus de la grippe humaine en laboratoire, le cercle d'hôtes parmi les animaux de laboratoire et l'isolement du virus du matériel clinique
    B.R.DAUDLE et G.S. SCHILD aux virus de la grippe (Schafer, 1955). En 1931, Shope passa la grippe porcine «classique» en administrant par voie intranasale un filtrat de sécrétions respiratoires. Premières données sur
  4. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions
    RV OIMPSON et VD BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. INTRODUCTION Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, et donc la plupart des informations sont fragmentées dans sa composition de si un grand nombre de problèmes non résolus. La principale déclaration sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus génomiques négatifs.
  5. Virus de la grippe et grippe
    E. D. KILBOURNE I. INTRODUCTION. INFLUENZA - UNE MALADIE AUX SYMPTOMATIQUES INCHANGEABLES, CAUSÉE PAR UN VIRUS CHANGEABLE L'énorme intérêt suscité par la virologie moderne pour la grippe et les virus responsables de son apparition nécessite une explication, étant donné la nature ordinaire des symptômes de cette infection respiratoire, généralement très légère,
  6. Structure du virus de la grippe
    P.V. SHOPPIN ET R.V. KOMPANS (PW CHOPPIN, J. W. COMPANS) I. INTRODUCTION L'étude du virus de la grippe est depuis longtemps «à la pointe des études structurales en virologie. Le virus de la grippe a été l'un des premiers à être étudié: en utilisant la microscopie électronique (Taylor et al., 1943), et lors de l'utilisation de cet objet particulier comme modèle, il a été «constaté que certains virus
  7. Réplication du virus de la grippe
    K. SHOLTISSEK et H.-D. KLENK (SN. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. INTRODUCTION Il existe un certain nombre d'études sur le problème de la réplication du virus de la grippe. La littérature jusqu'en 1968 est résumée dans des articles de Hoyle (1968) 'et Scholtissek (1969); les travaux ultérieurs sont des revues de White (1973), ainsi que Compans et Choppin (1974). La plupart des données sur la réplication obtenues dans l'étude du virus de la grippe de type A. Essentiel
  8. Variabilité antigénique du virus de la grippe
    RG WEBSTER et WG LEIVER i (RG WEBSTER et WG LAYER) I. INTRODUCTION Le virus de la grippe de type A1 est unique parmi les agents pathogènes des maladies infectieuses humaines en raison de sa capacité à modifier sa propre structure antigénique au point que l'immunité spécifique acquise la réponse "et l'infection par une souche est très faible ou ne protège pas contre la suivante
  9. Génétique du virus de la grippe
    A. SUGIURA I. INTRODUCTION. REVUE HISTORIQUE Ce chapitre n'est pas écrit pour donner un aperçu de toute la littérature relative à l'étude de la génétique du virus de la grippe. Cela se fait plus en détail dans les revues de Kjlbourne (1963) et Hoyle (1968). J'ai essayé de tracer, en essayant d'adhérer à l'ordre chronologique, uniquement pour les données qui ont directement conduit à des concepts importants et
  10. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine
    I. T. SCHULZE (I. T. SCHULZE) I. INTRODUCTION Le fait que les virus de la grippe ont la capacité d'agglutiner les globules rouges a joué un rôle important dans le développement de nos idées sur ces particules infectieuses. L'hémagglutination s'est révélée être une méthode extrêmement pratique pour identifier, purifier et déterminer la concentration de virus. De plus, depuis (le moment de la découverte du phénomène d'hémagglutinacip il y a 35 ans
  11. La nature chimique des acides nucléiques des virus
    De par leur nature chimique, les acides nucléiques des virus ne diffèrent pas des acides nucléiques des cellules (organismes) et sont des chaînes polynucléotidiques formées par l'alternance de quatre désoxyribonucléotides dans le cas de l'ADN ou des ribonucléotides dans le cas de l'ARN lié par des liaisons phosphodiester. Le nucléotide est une base azotée (adénosine (A), guanosine (G), cytidine (C),
  12. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase
    D. BOOKER et P. PALEYSE I. BUCHER I. INTRODUCTION L'existence de la neuraminidase a été suggérée pour la première fois dans le travail désormais classique de Hirst (1942). Il a constaté que si les globules rouges agglutinaient en présence du virus de la grippe désagglutiné, alors lorsqu'un nouveau virus leur était ajouté, ils ne pouvaient à nouveau pas s'agglutiner. Cependant, le virus élué ne
  13. VIRUS ET ÉVOLUTION DES ACIDES NUCLÉIQUES
    VIRUS ET ÉVOLUTION NUCLÉINE
  14. ACIDE ACÉTIQUE (ACIDE ÉTHANIQUE, ACIDE MÉTHANIQUE CARBONIQUE)
    INFORMATIONS GÉNÉRALES Formule empirique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C2H4O2 Formule structurelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CH3COOH Poids moléculaire, kg / kmol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60.05 État agrégé. . . . . . . . . . . . . . .
  15. Pays avec des cas humains de grippe aviaire et plan d'action mondial de l'OMS contre la grippe
    À ce jour, des cas humains ont été signalés dans sept pays, dont la plupart se trouvent en Asie: Vietnam, Indonésie, Iraq, Cambodge, Chine, Thaïlande et Turquie. Chez les premiers patients enregistrés au Vietnam, les symptômes de la maladie sont apparus en décembre 2003 lors de la flambée actuelle, et l'infection H5N1 a été confirmée le 11 janvier 2004. Rapports de Thaïlande
  16. ACIDE ASKORBINIQUE (ACIDE Y-LACTONE 2,3-DÉSHYDROGULIQUE, VITAMINE C)
    INFORMATIONS GÉNÉRALES Formule empirique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . С6Н8О6 Masse moléculaire, kg / kmol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176.14 L'état d'agrégation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aspect solide. . . . . . . . . . . . . . . . .
  17. Acide salicylique et ses dérivés (acide acétylsalicylique et autres)
    IMAGE CLINIQUE À la suite d'un surdosage répété, des nausées, des douleurs abdominales, des vomissements, de la diarrhée, des acouphènes, des troubles de l'audition et de la vision, des étourdissements, des maux de tête, des arythmies cardiaques, une hypotension artérielle se produisent. En cas d'intoxication grave, une altération de la conscience (du délire à la somnolence et au coma) se développe, souvent des convulsions, un collapsus, une diathèse hémorragique, une hémolyse. ACTIONS D'APPEL
  18. Abstrait. Virus. Caractéristiques de l'ontogenèse et du cycle de reproduction des virus contenant de l'ADN et de l'ARN., 2008
    Caractéristiques de l'ontogenèse et du cycle de reproduction des virus contenant de l'ADN et de l'ARN. Virus, caractéristiques de leur structure et de leur activité. Classification. différences, structures,
  19. ACIDE BENZOIQUE (ACIDE BENZOLIQUE CARBONIQUE)
    INFORMATIONS GÉNÉRALES Formule empirique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . С7Н6О2 Formule structurelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C6H5COOH Masse moléculaire, kg / kmol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.13 L'état d'agrégation. . . . . . . . . . . . . . . . .
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com