Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Parasitologie médicale / Anatomie pathologique / Pédiatrie / Physiologie pathologique / Oto - rhino - laryngologie / Organisation d'un système de santé / Oncologie / Neurologie et neurochirurgie / Héréditaire, maladies génétiques / Maladies transmises par la peau et les maladies sexuellement transmissibles / Antécédents médicaux / Maladies infectieuses / Immunologie et allergologie / Hématologie / Valeologie / Soins intensifs, anesthésiologie et soins intensifs, premiers soins / Hygiène et contrôle sanitaire et épidémiologique / Cardiologie / Médecine vétérinaire / Virologie / Médecine interne / Obstétrique et gynécologie
Accueil
À propos du projet
Actualités médicales
Pour les auteurs
Livres autorisés sur la médecine
<< Précédente Suivant >>

La culture des virus de la grippe humaine en laboratoire, le cercle d'hôtes parmi les animaux de laboratoire et l'isolement du virus du matériel clinique

B.R.DAUDLE et G.S. SCHILD (WR DOWDLE, G. C. SCHILD)



I. INTRODUCTION

Pour la première fois, le passage du virus de la grippe dans l'expérience a été effectué au début du siècle lorsque l'on travaillait avec le VPH, mais jusqu'en 1955, il n'était pas attribué aux virus de la grippe (Schafer, 1955). En 1931, Shope passa la grippe porcine «classique» en administrant par voie intranasale un filtrat de sécrétions respiratoires. Les premières données sur l'infection d'animaux de laboratoire par le virus de la grippe humaine ont été obtenues par Smith et al. (1933). Les auteurs ont montré que les furets infectés par des sécrétions des voies respiratoires d'une personne grippale développaient une infection respiratoire accompagnée de fièvre et se propageant naturellement entre eux. Ces résultats ont été rapidement confirmés par Francis (1934). Il a ensuite été montré que chez les souris qui injectaient de l'iode iode avec du matériel prélevé sur les cornets de furets malades, une pneumonie s'est développée (Andrewes et al., 1934). Ces études ont conduit à l'utilisation d'animaux de laboratoire pour déterminer l'infectiosité du virus et ont fourni une accumulation rapide de connaissances sur les propriétés des virus grippaux et l'immunité à cette infection.

Burnet (1940) a découvert que le virus de la grippe peut se multiplier dans les «germes qui tapissent les cavités allantoïdiennes et amniotiques de l'embryon de poulet, ce qui était important pour l'étude des virus de la grippe. Il a été possible d'éviter les désagréments liés au travail sur des animaux de laboratoire, ainsi que la possibilité d'obtenir le virus de la grippe en grande quantité sous la forme d'un liquide allantoïdien d'embryons infectés. De plus, il est devenu «possible d'isoler directement le virus de la grippe» dans les embryons, sans l'adapter au préalable aux furets ou aux souris, ce qui pourrait entraîner une contamination accidentelle du virus par des agents étrangers. La découverte des propriétés hémagglutinantes des particules virales (Hirst, 1941) a également été d'une grande importance, car elle a permis de détecter le virus sans avoir à démontrer ses propriétés infectieuses. L'étape suivante, qui était d'une importance évidente pour l'étude de la réplication du virus de la grippe, a été la culture du virus dans des cultures cellulaires (Mogabgab et al., 1954). Le développement de systèmes de plaques dans des cultures cellulaires monocouches pour déterminer le virus infectieux ™ a finalement permis d'obtenir des clones purs du virus de la grippe pour des expériences génétiques.

II. CULTURE DE VIRUS EN CONDITIONS DE LABORATOIRE

A. CULTURES CELLULAIRES

Introduction de virus grippaux A ou B dans (La culture cellulaire provoque l'un des trois effets: 1) le virus se multiplie avec différentes efficacités, formant une progéniture infectieuse (infection productive); 2) le virus passe par un cycle de reproduction incomplet avec formation d'un incomplet (virus à la surface des cellules ou particules virales non infectieuses dans le milieu (infection avortée); 3) le virus ne parvient pas à infecter le film. Certaines données expérimentales (suggèrent qu'il est possible d'établir l'état d'une infection chronique dans laquelle (de petites quantités du virus infectieux sont libérées dans le milieu pendant une longue période (infection persistante).

1. Infection productive

Le cycle réplicatif des virus grippaux est décrit en détail.

au chap. 8. Après l'introduction du virus <dans la «culture des adhésifs sensibles»

le courant suit une période "d'éclipse" ^ qui dure environ

environ 2 heures, pendant lesquelles aucune

«manifestations biologiques ou sérologiques de la synthèse

protéines virales. Pendant cette période, la synthèse du virus

des iolipeptides spécifiques, y compris des virus spécifiques

composants oxy non incorporés dans le virion.

Environ 2 heures après l'infection dans les cellules,

détecter l'antigène nucléothéidique (NP). Montant de cette

composant atteint un maximum par 5-6 heures après l'aube

zheniya. La présence d'hémagglutinine ou de surface

les tigènes dans les extraits cellulaires sont détectés 3 heures après

infection. Un virus en herbe peut être détecté sur

membranes cellulaires environ 5 '/ g h après l'aube

zheniya. Peu de temps après, environ 6 heures après l'aube

zheniya, le virus commence à pénétrer dans l'environnement, et infectieux

atteint sa concentration maximale dans le milieu par

7-8 heures après l'infection

Lorsqu'elles sont infectées par (virus de la grippe humaine de diverses cultures primaires) de cellules obtenues à partir des tissus d'oiseaux ou de mammifères qui s'y trouvent (il existe un cycle productif. Une liste de ces cultures peut être trouvée dans Hoyle (1968). Afin de ne pas répéter cette liste, nous allons essayer de résumer les réalisations les plus importantes réalisées par un certain nombre de chercheurs au cours de plus de 20 ans de travaux expérimentaux.

Les cellules épithélioïdes sont le système le plus sensible pour la culture in vitro d'une large gamme de souches de virus grippaux A et B. Le plus souvent, elles sont utilisées à ces fins, les reins fœtaux humains (Mogabgab et al., 1954), les singes rhésus ou les singes verts (Mogabgab et al., 1961), reins de veaux (Haas, Wulff, 1957; Lehmann-Grube, 1965), porcs. (Lehmann-Grube, 1964), ainsi que des hamsters (Heath, Tyrrell, 1959). Parmi ceux-ci, les cellules primaires des reins, des singes, des humains et des veaux sont plus souvent utilisées. Habituellement, ils préfèrent les reins de singe, en raison du taux de croissance et de la commodité. exceptionnel.

Toutes les cultures de cellules éliteloïdes ne sont pas permissives pour le virus (grippe. Les cellules diploïdes et hétéroploïdes primaires de l'amnios humain, ainsi que d'autres (cellules épithéliales hétéroploïdes, y sont généralement insensibles. Ces lignées comprennent le yasak HeLa, KB, les cellules conjonctivales (vert) et al., 1957), ainsi que le MAF et les cellules cardiaques et intestinales humaines (Wong, Kilbour-ne, 1961).

Les cultures de cellules épithéliales dérivées d'organes ont une sensibilité plus uniforme aux virus de la grippe que les cultures dérivées d'organes de l'embryon. Selon nos données, les cultures cellulaires faites à partir de reins mort-nés (les nourrissons sont aussi sensibles aux virus de la grippe que les cultures de cellules rénales de singe, et les cultures de cellules rénales embryonnaires humaines sont moins sensibles. Un problème important lors de l'utilisation de reins embryonnaires humains est la différence de sensibilité entre différents les reins sont généralement obtenus à partir d'embryons d'âges différents, les conditions de leur production varient également, entraînant un fort (pourcentage fluctuant de cellules viables. Ces facteurs Ils conduisent à une grande diversité dans le rapport entre les cellules épithélioïdes et fibroblastoïdes dans les cultures de l'embryon et des reins humains, ce qui, à son tour, peut entraîner des variations importantes de la sensibilité virale. Les cellules épithélioïdes, contrairement aux cellules fibroblastoïdes, favorisent la réplication du virus. en ce qui concerne les cellules de rein de porc, les cultures dérivées de reins de porc adultes sont principalement constituées de cellules épithélioïdes qui soutiennent la réplication du virus de la grippe. Les cultures dérivées de reins embryonnaires sont presque entièrement représentées par des fibroblastes et sont pratiquement insensibles au virus (Lehmann-Grube, 1964). Ce schéma est valable pour de nombreuses espèces.

La sensibilité des cellules épithélioïdes à l'infection grippale diminue avec la sous-culture. Dans certains cas, par exemple, lorsqu’on utilise le «doigt d’un rein d’embryon humain, le sous-parasage favorise la prolifération de fibroblastes insensibles au virus. Dans d'autres cas, par exemple, lors de l'utilisation de reins de singe (Dowdle, données non publiées) et de veaux (Lehmann-Grube, 1964), les cultures cellulaires conservent leurs propriétés épithélioïdes pendant de nombreux passages, mais leur sensibilité aux virus change déjà lors de la première sous-culture. Diploïdie des cellules épithélioïdes (les cellules seules ne déterminent pas encore la sensibilité aux virus.

Certains virus peuvent se multiplier ou acquérir la capacité de se multiplier après adaptation dans des fibroblastes ou dans des lignées cellulaires hétéroploïdes, mais il existe peu de ces souches. La souche NWS du virus de la grippe A (iHONl) est unique dans l'étendue du spectre cellulaire; il peut se multiplier dans les cellules épithéliales hétéroploïdes (Wong, Kilbourne, 1961), dans les fibroblastes (Kilbourne et al., 1964) et IB MDBK, une lignée de cellules rénales bovines hétérobloïdes (Choppin, 1969). Le virus de la grippe B est également capable de se multiplier dans la lignée hétéroploïde obtenue à partir des reins des chiens (Green, 1962).

La spécificité par rapport à la cellule hôte ne peut pas toujours être prédite. Les virus de la grippe porcine ne se propagent pas dans les cultures de cellules rénales humaines (Hinz et Syverton, 1959), mais les virus de la grippe humaine se multiplient bien dans les cellules rénales porcines (Lehmann-Grube, 1964). La culture de cellules rénales de singe est insensible aux virus de la grippe équine (Heq2Neq2) lorsqu'elle est directement infectée par du matériel clinique, mais les mêmes virus se multiplient dans les cellules rénales de singe après un passage sur des embryons de poulet (Dowdle et al., 1963).

L'élimination insuffisamment complète des composants sériques avant l'inoculation du virus est l'une des principales raisons de l'isolement du virus dans un petit pourcentage de cas et de l'obtention de titres infectieux faibles dans les cultures de cellules sensibles. Les composants sériques, qui sont un composant nécessaire du milieu pour la croissance cellulaire, peuvent neutraliser non spécifiquement le virus. C'est le plus grand

le degré concerne les virus isolés après 1957. L'effet inhibiteur du sérum peut être éliminé par lavage double ou multiple des cellules avec un milieu sans sérum.

2. Infection avortée

Henle et al. (1955) ont été les premiers à montrer que les cellules HeLa (provenant d'un carcinome du col de l'utérus humain) infectées par une grande multiplicité de virus propagés sur des embryons de poulet produisent des particules hémagglutinantes non infectieuses. Une infection avortée est également observée dans les cellules L infectées par le FPV (Franklin, Breitenfeld, 1959), ainsi que dans diverses lignées cellulaires infectées par le virus de la grippe porcine (Wong, Kilbourne, 1961), et dans les cellules tumorales acétiques Krebs-2 (Low et al:, 1962), dans les cellules BHK-21 (Fra-ser, 1967) et dans les cellules BSC-1 (Nikitin et al., 1972). Une infection avortée est observée non seulement dans les cellules hétéroploïdes, mais également dans les fibroblastes diploïdes humains (Kilbourne et al., 1964).

Le mécanisme de l'infection par l'avortement n'est pas entièrement clair; une étape du cycle de reproduction du virus est probablement bloquée. Dans des expériences sur l'étude des cycles de reproduction incomplets du virus de la grippe dans les cellules HeLa (Henle et al., 1955) ou dans les cellules L (Franklin, Breitenfeld, 1959), la formation d'une quantité significative d'antigène NP et de particules hémagglutinantes a été notée. Loffer et al. (1962) ont montré qu'avec une infection avortée dans les cellules HeLa, le NP s'accumule dans le noyau et les particules virales libérées ne contiennent pas la séquence complète des nucléotides d'ARN viral. Choppin et Pons (1970) ont constaté que le plus grand des fragments d'ARN viral manquait dans ces particules non infectieuses hémagglutinantes, mais il y avait un nombre accru de petits fragments d'ARN. Ces auteurs ont également constaté que les cellules HeLa peuvent produire un virus infectieux s'il n'y a pas d'inoculum virus incomplet. À cet égard, une infection avortée dans les cellules HeLa est similaire aux phénomènes classiques de von-Mairayea, c'est-à-dire la production d'un virus incomplet dans des embryons de poulet.

3. Infection persistante

Un certain nombre de données expérimentales suggèrent la possibilité d'une infection chronique accompagnée d'une faible production virale causée par des virus grippaux dans les cultures de tissus. Tyrrell (1959) a décrit une infection chronique de la culture de cellules rénales de veau par le virus WS. Gavrilov et al. (1972) ont constaté que trois passions des reins féminins

son infecté par le virus WSN, le virus a pu être détecté pendant 105 jours. Willinson et Barland (1972) ont montré la persistance du virus P.JR8 pendant 50 jours après l'infection avec la culture du poumon d'un poumon humain. Dans la culture, aucun effet cytioïde ne s'est développé et de petites quantités de virus infectieux ont été trouvées dans le liquide de culture. De tels rapports indiquent qu'au moins certaines souches du virus de la grippe peuvent provoquer le développement d'une infection chronique à court terme, mais une «véritable» infection persistante par le virus de la grippe n'a pas encore été démontrée.

4. Paramètres d'infection

a) Composants spécifiques au virus dans la cellule. La méthode des anticorps fluorescents (AF), proposée par Weller et Coons (1954), a été largement utilisée comme test immunologique pour «l'identification et la localisation d'antigènes spécifiques du virus dans les cellules infectées». Les méthodes directes et indirectes d'immunofluorescence appliquées aux virus ont été décrites en détail dans une revue de Liu (1969). Plus tôt que d'autres, cette méthode a été appliquée au virus de la grippe Watson <et Coons (1954), ainsi qu'à Liu (1955), qui ont montré une localisation principalement nucléaire de la fluorescence due à l'antigène NP dans les cellules infectées par le virus de la grippe. Par la suite, cette méthode a été largement utilisée pour étudier la distribution des antigènes du virus de la grippe à différents moments du cycle de reproduction du virus. Maepo et Kilbourne (1970) ont décrit la distribution du NP, de l'hémagglutinine et de la neuraminidase. Oxford et Schild (1974) ont étudié la distribution des quatre principaux antigènes viraux, y compris la protéine M.

Oxford et Schild (1968) ont tenté de titrer le virus de la grippe en culture cellulaire en utilisant la technique des anticorps fluorescents, qui a décrit la technique du «comptage des centres infectieux pour estimer le nombre de cellules fluorescentes».

Dimmock (1969) a détecté la présence d'un antigène spécifique du virus dans les nucléoles des cellules infectées par le virus de la grippe. L'antigène peut être détecté en utilisant la méthode FA en utilisant des sérums de souris infectées, mais des non-sérums préparés contre des particules virales. La fluorescence dans les nucléoles est apparue aux premiers stades de l'infection et, selon l'auteur, était due à l'antigène viral qui s'accumule dans les cellules infectées, mais pas incorporé dans les particules virales.

La méthode FA est très sensible.

de petites quantités d'antigène ou d'anticorps, mais il peut produire

coloration non spécifique, donc, contrôle de préparation

Les évaluations sont strictement requises. Pour détecter certains:

antigènes, il est nécessaire d'utiliser des antiserums hautement spécifiques obtenus par immunisation avec des antigènes purifiés.

La technique du marquage radioactif a été largement utilisée pour détecter les protéines virales intracellulaires dans la reproduction du virus de la grippe. Becht (1969) a utilisé l'étiquette avec des précurseurs radioactifs et une autoradiographie afin de montrer la localisation principalement nucléaire du NP. D'autres auteurs (Joss et al., 1969; Taylor et al., 1969; Ske-hel, 1972) ont utilisé un marqueur radioactif et PAAGE. Ces études seront décrites en détail ci-dessous, et ici elles ne seront que mentionnées. L'une des méthodes les plus efficaces a été l'utilisation de la 358-méthionine, qui est efficacement incorporée dans les protéines virales. Skehel (1972), en utilisant cette méthode, a découvert la synthèse de 9 polypeptides dans des cellules infectées par le virus de la grippe. Sept d'entre eux correspondent à des polypeptides structuraux connus du virus. Deux polypeptides (8 et 9) ne peuvent pas être identifiés avec les composants structurels du virus; ils étaient considérés comme des produits codés par des virus non inclus dans les particules virales. Ces composants sont détectés peu de temps après l'infection (Skehel, 1973), mais leur importance pour le processus d'infection est inconnue.

Des méthodes telles que le marquage immunoferritif suivi de la microscopie électronique n'ont pas donné de résultats significatifs lors de la tentative d'identification des antigènes intracellulaires dans les cellules infectées par le virus de la grippe. L'un des principaux obstacles ici était la liaison non spécifique de l'immunoferritine aux protéines d'érable. Cependant, ces méthodes ont été utilisées avec succès pour identifier des antigènes viraux à la surface des cellules.

b) Composants viraux à la surface de la cellule. La technique d'hémadsorption (Had), proposée par Vogel et Shelokov (1957), est sensible à la détection d'hémagglutinine à la surface d'une cellule infectée. Avec cette méthode, des cobayes, des poulets ou des érythrocytes humains sont introduits dans une culture cellulaire infectée, qui est ensuite lavée et incubée dans un milieu sans sérum. La présence du virus est déterminée par la présence de groupes de globules rouges liés à la surface de la couche cellulaire. Les globules rouges qui sont agglutinés par ce virus doivent être utilisés. Le plus largement utilisé pour (l'hémi-adsorption était la culture de cellules rénales de singe et de veau. La culture de cellules d'embryons de poulet peut être appliquée à certaines souches de virus sifflants aviaires de type A. Le had est une méthode utile et sensible pour détecter une infection virale, mais il convient de la garder à l'esprit; la possibilité de contamination des cultures par la temagglutination agents, par exemple,

la possibilité de la présence du virus SV5 dans la culture de cellules rénales de singe. De plus, les vieux globules rouges sont adsorbés de manière non spécifique sur les cellules rénales en culture (Dowdle, Robinson, 1966). Had est largement utilisé comme méthode de titration de l'infectiosité du virus de la grippe. Il est à noter que les souches qui subissent un cycle de réplication incomplet dans certaines cellules hôtes peuvent donc moins provoquer des Had dans ces cultures.

Un substrat chromogène synthétique de la neuraminidase acide 2- (3-métokeiphényl) -N-acétylneuraminique (MPN) (Tuppy, Palese, 1969) a été utilisé pour déterminer l'activité de la neuraminidase en culture pendant la réplication du virus de la grippe. Palese et al. (1970) ont réussi à identifier les foyers de propagation du virus dans une culture monocouche en ajoutant le sel de diazonium MPN i du 4-amino-2,5-di-méthoxy-4 / -nitroazO'benzal. Ces foyers ont été colorés en rouge car le 3-méthoxyphénol libéré du MPN par NA * a réagi avec le sel de diazonium pour donner une coloration rouge. Фокусы активности NA*, т. е. очаги размножения вируса, могли быть обнаружены этим методом даже при отсутствии локального цитопатического эффекта.

Этот метод может быть использован при изучении генетики. Palese и Schulman (1974) с помощью MPN-хромофорного метода идентифицировали два типа инфекционных очагов в однослойной культуре линии клеток 'Конъюнктивы человека, зараженной клонированным рекомбинантом вируса гриппа. Были обнаружены ярко и слабоокрашенные участки, соответствующие двум генетически различным компонентам вирусной популяции, имеющим соответственно высокое и низкое соотношение активностей NA* и НА*.

Метод ФА нередко используется для обнаружения антигенов вируса гриппа на поверхности /клеток. Необходимо, чтобы при этом оболочка клетки не повреждалась, что предотвращает проникновение в клетку реагентов. Rutter и Mannweiler (1973) описали появление вирусспецифических антигенных детерминант на (поверхности клеток HeLa, зараженных вирусом гриппа; при этом использовали непрямую иммунофлюоресценцию и нефиксированные клетки. Флюоресценцию обнаружив а ля на поверхности клеток через 4 ч; после заражения; через 8 ч она достигала максимума. Oxford (личное сообщение) обнаружил интенсивное свечение на поверхности зараженных клеток MDBK и первичной культуры клеток почки теленка при использовании антисывороток против очищенных NA* и НА*. На основании полученных данных невозможно было с достоверностью говорить о различном распределении этих антигенов на поверхности клетки, хотя флюоресценция при использовании сыворотки: против темаглютинина была сильнее, чем при использовании антинейра-минидазной сыворотки, что, видимо, указывает на большее количество НА на поверхности клетки по сравнению с количеством NA. Хотя Rutter и Mannweiler обнаружили «полярное» скопление антигенов вируса гриппа на одной стороне клетки, в опытах Oxford ;и НА* и NA* были распределены равномерно.

Для определения антигенов вируса гриппа на поверхности зараженных клеток с помощью электронной микроскопии Morgan и соавт. (1961) использовали иммуноферритиновый метод с применением противогриппозной сыворотки, конъюги-рованной с ферритином. Подобные методы можно применять и для специфической цдентификации антигенов на поверхности клеток при использовании антисывороток против очищенных вирусных антигенов: НА*, NA*, NP и белка мембраны..

в) Вирусные компоненты, освобождаемые из клеток. Освобождение синтезированных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток осуществляется путем «почкования» на: протяжении длительного периода, начиная с 5—6-го часа после заражения. Зараженные клетки постепенно дегенерируют с развитием цитопатических изменений. Помимо вирусных частиц, в культуральную среду может выходить и «растворимый» Р-антиген. За выходом вируса и «растворимого» антигена можно следить, определяя наличие вирусспецифических компонентов в культур ал ьной жидкости но биологической активности, или по присутствию вирусепецифических антигенов. Чаще всего для определения динамики выхода вируса из клеток используют тест гемагглютинации (Hirst, 1941). Определение активности NA* применяют для этой щели лишь в тех случаях, когда ставится специальная задача. Оба этих.теста позволяют определить главным образом наличие вирусных частиц. Связывание комплемента (РСК) часто применяют для обнаружения вирусного антигена в культур а ль-ной жидкости, причем используют антитела к NP или антитела к поверхностным антигенам (У-антисыворотки). Могут быть использованы и антисыворотки к очищенным гемагглю-тинину и нейраминидазе. Ори этом обнаруживаются как вирусные частицы, так и свободные поверхностные антигены, в то врехМЯ как при использовании антител ок белкам NP я М выявляются в основнОхМ «растворимые» антигены, а не вирусные частицы. Характеристика етих систем при определении биологических свойств вируса и количественном измерении гриппозных антигенов описана в гл. 12.

Инфекционные вирусные частицы обнаруживают с помощью того или иного метода титрования инфекционности. Чаще всего применяют наиболее чувствительный метод определения конечной точки титрования «а куриных эмбрионах.. Заражение куриных эмбрионов описано в разделе II, Г этой

главы. Инфекционную 50% дозу для эмбрионов (ЭИД50) рассчитывают по количеству эмбрионов, зараженных три инокуляции каждого разведения, по обычной формуле (Reed, Muench, 1938). Титры выражаются в ЭИД50 на 1 мл жидкости. Титрование инфекционности можно проводить с использованием метода культивирования фрагментов хорион-аллантоисвой оболочки на скорлупе (Fazekas de St. Groth, White, 1958), который описан далее, однако этот метод менее чувствителен, чем титрование на эмбрионах. Титрование вируса можно также проводить в культуре клеток способом, аналогичным титрованию на эмбрионах, но с определением инфицирования культуры по гемадсорбции, как описано ранее.

Цитопатический эффект редко 'используется в качестве показателя заражения культуры вирусом гриппа. Эти эффекты (Pereira, 1961) варьируют в широких пределах у разных штаммов и на различных культурах. Поскольку они имеют обычно характер дегенеративных изменений с грануляцией цитоплазмы, вакуолизацией, пикнозом ядер, сморщиванием и дезинтеграцией клеток, конечная точка титрования не может быть определена с точностью. Описаны базофильные ци-топлазматические включения в клетках, зараженных вирусом гриппа А, но они тоже варьируют (Soloviev, Alekseeva, 1960). Базофильные цитоплазм а тичес<кие включения часто наблюдаются также в «летках, зараженных некоторыми штаммами вируса гриппа В (Porebska et al., 1968).

Для некоторых вирусов гриппа, как, например для FPV или для нейротронных вариантов человеческих штаммов NWS и WSN, определение инфекционности может быть осуществлено подсчетам бляшек в монослойной культуре клеток с использованием какой-либо из методик, описанных в разделе ИВ. При использовании метода бляшек можно знать его чувствительность по отношению к титрованию на эмбрионах. Для перечисленных выше штаммов это соотношение приблизительно равно 1 : 1, но для большинства штаммов, выделенных у человека, и для большинства используемых для бляшек систем относительная чувствительность низка.

Б. МЕТОД НЕГАТИВНЫХ КОЛОНИИ [БЛЯШКИ]

Способность вирусов гриппа к образованию бляшек широко варьирует. Многие вирусы не образуют бляшек, а те, которые образуют, имеют весьма низкую эффективность бляш-кообразования, в особенности вирусы гриппа А. Способность к образованию бляшек есть индивидуальный признак штамма вне зависимости от принадлежности к тому -или иному серотипу.

Было описано образование бляшек в первичных культурах фибробластов (Simpson, Hirst, 1961), легких (Granoff,1955) и почек (Wright, Sagik, 1958) журиносго эмбриона. Фиб-робласты куриного эмбриона успешно использовались главным образом в работе с нейротропным штаммом NWS и с несколькими многократно пассированными лабораторными штаммами вирусов гриппа типов А и В. Наоборот, клетка почек куриного эмбриона является неплохой системой для получения бляшек со многими штаммами вирусов гриппа типа A (Beare, Keast, 1974).

Образование бляшек некоторыми вирусами гриппа А и В в монослое клеток куриного эмбриона можно усилить обработкой клеток ферментами: панкреатином (Came et al., 1968) или трипсином (Tobita, Kjlbourne, 1974). Механизм действия этих протеолитичеоких ферментов неясен. Возможно, что они модифицируют поверхность клетки, делая ее более чувствительной к адсорбции и проникновению вируса,, или же разрушают какой-то ингибирующий фактор, ассоциированный с клеткой или остающийся после удаления среды роста, содержащей сыворотку.

Клетки почак сирийского хомяка были описаны в качестве системы, высокочувствительной к вирусам гриппа А (Grossberg, 1964), причем вирусы образовывали бляшки без 'предварительной адаптации. В дальнейшем, однако, о каких-либо опытах, проведенных с этими клетками, не сообщалось,

Две системы наиболее широко применялись для бляшко-образования с разными вирусами .гриппа: первичные культуры клеток почек обезьян и бычьих почак. 'Большинство штаммов вирусов гриппа типов А и В, выделенных и пассированных на других хозяевах, не образуют бляшек на клетках почек обезьян, однако многие штаммы могут 'быть адаптированы и начинают образовывать бляшки после нескольких пассажей (Henry, Youngner, 1957; Choppin, 1962). Было высказано предположение (Takemoto, Fabish, 1963), что неэффективное бляшкообразование вирусами гриппа типа А обусловлено торможением адсорбции вируса на клетках, вызываемым сульфатированными полисахаридами агара. У некоторых штаммов количество и размер бляшек значительно увеличи-. вались при добавлении ДЗАЭ-декстрана в агар для связывания ингибиторов. Этот ингредиент сейчас используется как: составная часть агарового слоя в большинстве систем.

Клетки почек теленка, как отмечал еще Lehmann-Grube:

(1963) и недавно подтвердили Веаге и Keast (1974), являют

ся высокоэффективной системой для бляшкообразования, вы

зываемого вирусом гриппа В. Однородность результатов,

полученных с разными штаммами гриппа В, контрастирует

с широко варьирующими результатами, получаемыми с раз

ными штаммами вирусов гриппа А. О необходимости адап

тации вируса гриппа А для получения бляшек в культуре

бычьих почек достоверных данных нет.

Из этих двух культур клетки 'почек обезьян обладают лучшими качествами в отношении роста и способности переносить лабораторные .манипуляции. Клетки 'бычьих почек хорошо растут, wo легко отделяются от стекла после образования 'ОПЛОШНОГО МОНОСЛОЯ.

Все первичные культуры «леток имеют общий недостаток — они неоднородны по составу и, -кроме того, чувствительность к вирусам может сильно 'различаться в культурах, полученных от разных особей. Некоторые клетки (в особенности «летки почек обезьян и бычьих почек) нередко оказываются жонтаминированнымипосторонними агентами. В 'принципе эти препятствия могут быть устранены при работе с ге-тероплоидной линией клеток. Вариант Wong—Kilbourne линии клеток Чанга (клетки конъюнктивы человека) был успешно использован для бляшкообразования с вирусами гриппа А и В ((Sugiura, Kilbourne, 1965). На клетках этой линии образуют бляшки и штаммы вируса гриппа типа A (H3N2) из клинического материала (Rytel, Sedmak, 1973). Хотя пассаж через гетероплоидную линию клеток делает вирус непригодным для изучения на людях или для живой вакцины, эти данные имеют существенное значение для генетических исследований и серологических тестов.

В. ОРГАННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Однослойные и суспензионные культуры состоят из недифференцированных клеток и поэтому редко сохраняют спектр 'Чувствительности к вирусам, характерный для того органа, из которого они 'получены. Органные культуры представляют собой кусочки органов эмбриона или взрослого животного, поддерживаемые in vitro без пролиферации клеток и сохраняющие поэтому тот спектр чувствительности к вирусам, который данный орган имеет in vivo. ,По этой причине органные культуры оказываются весьма полезными системами для изучения in vitro взаимодействия между вирусом и чувствительными клетками хозяина.

Наиболее обширные исследования с 'использованием разных органных .культур, полученных от одного и того же вида животных (хорек), описаны в сообщениях Basarab и Smith (1969, 1970), Gould и соавт. (1972), Toms и со авт. (1974). Органные -культуры носовых раковин, мочевого пузыря, матки, трахеи, легких, конъюнктивы, яйцевода и пищевода обладали убывающей в этом порядке чувствительностью к вирусу гриппа A (H2N2), выращенному m куриных эмбрионах. Ткани пищеварительного тракта были нечувствительны, за исключением пищевода и глотки, которые могли быть заражены при использовании высокой дозы заражения. Нечувствительными оказались также мышечная, 'ретикулоэндотелиальная ткань, кровеносные сосуды и почка. В опытах, поставленных in vivo, при интраназальном заражении удавалось инфицировать только носовые раковины, легкие, трахею и пищевод, причем большая часть обнаруживаемого вируса содержалась в носовых раковинах. Мочевой пузырь и матка не были инфицированы, хотя, как было показано ранее, органные культуры этих тканей чувствительны к вирусу в такой же степени, <как и 'респираторные ткани. Оба этих органа могут -быть инфицированы при прямой урогенитальной инокуляции вируса (Basarab, Smith, 1970). Заражение урогенитальных тканей вирусом гриппа возможно не только у хорька. Rostoczy я соавт. (1973) обнаружили, что вирус гриппа типа А способен размножаться и в органной культуре эмбрионального эндометрия человека.

Поскольку ткани респираторного тракта являются главным 'местом размножения вируса in vivo, органные культуры, полученные из этих тканей, привлекали наибольшее внимание исследователей. Фрагменты слизистой с реснитчатым эпителием, полученные из трахеи и носовой полости ряда животных, оказались способными поддерживать весьма активную репликацию вируса гриппа; к фрагментам легочной ткани это относится в меньшей степени. Обсуждение использования органных культур для размножения вируса и перечисление использованных культур можно найти в обзоре Ноогп и Tyrrell (1969). Методы приготовления органных культур описаны там же, а также Cherry и Taylor-Robinson (1970).

Данные по оценке 'эффективности клеток реснитчатого эпителия для выделения вирусов гриппа весьма немногочисленны. В тех ограниченных исследованиях, которые проводились в этом направлении, не обнаружено заметных преимуществ органной культуры трахеи эмбриона человека перед первичной культурой почек макак резусов для выделения вирусов гриппа A (Roome et al., 1971) или В (Votava, Tyrrell, 1970).
Кроме того, культуру трахеи человека труднее получать и она менее удобна в обращении, чем обычные культуры клеток.

Было проведено сравнение органных культур трахеи куриного эмбриона с первичной культурой клеток почки зеленой мартышки для выделения вируса гриппа A (Blascovic et al., 1972b). Приблизительно одинаковое число штаммов было выделено в каждой системе, так же как в обеих системах. Авторы предложили использовать обе системы для выделения максимального количества штаммов. Использование органной культуры трахеи куриного эмбриона не сравнивали с обычным заражением куриных эмбрионов, которое несравненно проще.

Поскольку чувствительность тканей к вирусам в органных культурах подобна таковой в интактном организме, по-

лагают, что и действие противовирусных веществ должно быть сходным. Если это так, то органные культуры должны оказаться полезными для оценки действия противовирусных препаратов. Здесь, однако, имеются как положительные, так и отрицательные стороны. 'С одной стороны, фрагмент органа, удаленный из организма, не подвергается нормальной физиологической регуляции, что может отразиться на эффективности препарата. С другой стороны, концентрация препарата и продолжительность контакта могут лучше контролироваться в органных культурах. Tyrrell и соавт. (1965) первыми использовали реснитчатый эпителий человека в органной культуре для оценки in vitro действия противогриппозного препарата (амантадин). Herbst-Laier (1970) исследовал широкий круг органных культур, включая эксплантаты трахеи мышей, хомяков, хорьков, крыс, собак, обезьян, свиней « телят, а также носовых раковин собак и хорьков. Из них наиболее пригодными для оценки размножения (и его подавления) прототипных штаммов вирусов типов А и В оказались органные культуры трахеи собак и хорьков. В культуре трахеи собак обнаруживались специфические гистологические изменения, которые автор рассматривает как более надежный критерий оценки, чем титр вируса как таковой. Характерные и постоянные цитопатические изменения были также обнаружены Blascovic и соавт. (1972а) в органных культурах трахеи куриного эмбриона, зараженных вирусом гриппа А (Гонконг/68); это позволяет полагать, что и данная культура может оказаться полезной.

Использование органных культур реснитчатого эпителия было предложено для определения спектра хозяев вновь выделенных штаммов вируса гриппа A. Schmidt и соавт. (1974) сообщили, что при заражении таких культур, полученных из органов кур, лошадей, хорьков и свиней, вирусами, выделенными 'у. людей, свиней лошадей и птиц, чувствительность культур коррелировала с пассированием штамма в том или ином хозяине в природных условиях.

Органные культуры могут быть использованы и для отбора штаммов-кандидатов для получения живых вакцин. Mos-tow и Tyrrell (1973) описали определенную корреляцию меж-'ду способностью вируса снижать подвижность ресничек эпителия и повреждать клетми в органной культуре трахеи эмбриона человека и его способностью вызывать заболевание у людей. Эта корреляция, однако, не наблюдалась с органными культурами хорьков и не распространялась на все штаммы вирусов гриппа (Нага et al., 1974). Вирусы гриппа типа В обнаружили одинаковую патогенность для органных культур трахеи человека при различной вирулентности для людей. Поэтому представляется очевидным, что, хотя органные культуры имеют много достоинств для вирусологических

исследовании, нельзя считать, что орган, разрезанный на кусачки и поддерживаемый вне организма в искусственной среде, реагирует на инфекцию точно так же, как в интактном организме.

Г. КУРИНЫЙ ЭМБРИОН

Куриные эмбрионы широко используются для выделения и размножения вируса еще со времени первого описания заражения в полость амниона (Burnet, 1940). Классическая работа Beveridge и Burnet по культивированию вирусов и рик-кетсий в курином эмбрионе была опубликована в 1946 г. С тех пор почти не было получено существенных дополняющих данных.

Некоторые ранние рекомендации сейчас выглядят, однако, устаревшими в связи с биологической изменчивостью вирусов гриппа. В 40чх тодах для выделения вирусов гриппа типов А и В рекомендовалось заражение 13—14-дневных эмбрионов в полость амниона, а для адаптированных в лаборатории штаммов — заражение в полость аллантоиса 10— 12-дневных эмбрионов. Вплоть до 1968 г. выделение вирусов гриппа А и В можно было осуществить, как правило, лишь посредством заражения в полость амниона и для успешной адаптации требовалось много пассажей. Очень редко выделяли штамм путем заражения в полость аллантоиса. С 1968 г. человеческие штаммы вируса гриппа А выделяются с одинаковой легкостью при обоих путях заражения: введение материала в полость амниона не дает никаких преимуществ. В отношении вируса гриппа типа В на протяжении многих лет тоже можно наблюдать изменения. Поскольку трудно предсказать заранее предрасположение штамма того или другого вируса к размножению при определенном способе введения, в качестве стандартной процедуры рекомендуется заражение 11-дневных эмбрионов в полость как амниона, так и аллантоиса.

Неадаптированные вирусы, введенные в амнион 13-дневных эмбрионов, размножаются первоначально в трахее и легких. Они могут вызывать гибель эмбриона, но могут и не вызывать ее .Вирусы, многократно пассированные этим путем, размножаются в амниотической оболочке и эпителиальных покровах эмбриона, а также в респираторных путях, вызывая множественные кровоизлияния и быструю гибель его. После нескольких пассажей штамм приобретает способность размножаться при заражении в полость аллантоиса.

Штаммы, не адаптированные к куриному эмбриону (фаза О—от original, т. е. исходная), нередко дают более высокие титры гемагглютинина с эритроцитами морской свинки или человека, чем с куриными эритроцитами. 'После адаптации (фаза D — от derived, т. е. производное) вирус обычно

агглютинирует куриные эритроциты до тех же титров, что эритроциты млекопитающих. Этот переход из фазы О в фазу D (Burnet, Bull, 1943) наблюдается не 'всегда. Большинство штаммов вирусов гриппа А и В, выделенных после 1968 г., агглютинируют эритроциты морокой свинки и куриные эритроциты до одинаковых титров.

Адаптированные вирусы, введенные в полость аллантоиса Подневного куриного эмбриона, размножаются предже всего в энтодермальных -клетках хорион-аллантоисной оболочки, хотя вирус можно обнаружить также в клетках амниотиче-ской оболочки и респираторных путей.

Накопление вируса в полости аллантоиса имеет очевидные преимущества, поскольку получается большой объем вирусеодержащего материала и его легко собирать. Хорошо адаптированные штаммы могут давать 109—1011 вирусных частиц на 1 мл. Вирус одинаково хорошо размножается в эмбрионах от 10- до 13-дневното возраста, но объем аллан-тоиеной жидкости резко уменьшается, начиная с 13-го дня. Кроме того, у эмбрионов 'более раннего возраста содержится меньше солей мочевой кислоты ш аллантоисной жидкости; по мере развития эмбриона их содержание нарастает. Эмбрионы, зараженные в 12—'13-дневном возрасте, содержат аллантоисную жидкость, которая мутнеет сразу после охлаждения; за несколько дней в ней образуется обильный осадок. Осадки -солей мочевой кислоты содержат вирус и их образование может резко снижать титр вируса в жидкости.

Величина заражающей дозы вируса -может существенно влиять на его урожай. Рекомендуется использовать дозы от 104 до Ю5 ЭИД50 на 1 мл. При использовании более низкой дозы урожай вируса может быть низким, а динамика репродукции— неравномерной. Более высокие заражающие дозы могут вести ,к снижению урожая (Miller, 1944). При этом может также развиваться эффект фон Магнуса (von Magnus, 1952), т. е. увеличение отношения неинфекционных частиц <к инфекционным. Этот феномен обсуждается в гл. 1.

Для некоторых специальных исследований может оказаться необходимым культивирование (вируса в клетках оболочки аллантоиса без репродукции вируса в других тканях эмбриона. Для'таких исследований могут использоваться .деэмбрио-нированные яйца (Bernkoff, 1949). Однако урожай вируса в них гораздо ниже, чем в ннтактных эмбрионах, и этот метод не может быть рекомендован для постоянного использования.

Д. ФРАГМЕНТЫ ХОРИОН-АЛЛАНТОИСНОЙ ОБОЛОЧКИ НА ЯИЧНОЙ СКОРЛУПЕ

Поскольку эксперименты, требующие заражения большого числа куриных эмбрионов, дороги и трудоемки, преимущества техники, позволяющей провести такой же опыт с исполь-

зованием фрагментов одного яйца, очевидны. При этом достигается и однородность ткани, поскольку снимается проблема неодинаковой чувствительности разных эмбрионов к вирусу.

Fulton и Armitage (1951) первыми предложили способ разрезания хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) на маленькие кусочки и их поддержания в чашках на пластиковых досках, но титры вируса при этом (были значительно ниже, чем в интактном эмбрионе. Fazekas de St. Groth и White (1958) улучшили методику, изменив среду и использовав кусочки, не отделенные от скорлупы. (При этом скорлупа забу-феривала среду и служила опорой для ткани; экспонировалась максимальная поверхность, причем только та сторона оболочки, которая чувствительна к вирусной инфекции. Инфекционные титры большинства штаммов гриппа А в такой системе не уступают титрам :в интактном эмбрионе. Размножение вируса гриппа В шло менее успешно. Эта методика особенно удобна для титрования инфекционности и для реакции нейтрализации с вирусом гриппа А, а также для быстрого выделения и клонирования рекомбинантов вирусов гриппа A (Webster, 1970).

Ш. КРУГ ХОЗЯЕВ СРЕДИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

А. ХОРЬКИ

Вирус гриппа человека А был впервые выделен на хорьках (Smith et al., 1933). С тех лор хорькам уделяли много внимания, сначала как средству выделения вируса, а позднее как модели для изучения патогенности и иммунологии гриппа.

Хорьки высоковосприимчивы к заражению вирусами гриппа типа А. Интраназальное введение инфекционного вируса вызывает через 48 ч температурную реакцию, которая может длиться от 24 до 72 ч. У животных в этот период развиваются симптомы гриппа: ринит, чиханье, насморк, потеря аппетита, вялость. Вирус выделяется во внешнюю среду на протяжении первых дней заболевания и легко может передаваться незараженным хорькам и людям (Smith, Stuart-Harris, 1936). Хорьки могут заражаться от человека естественным путем при контакте, поэтому при экспериментальном заражении следует заранее убедиться ш отсутствии у них антител к циркулирующим среди людей вирусам гриппа.

Сообщалось, что хорьки были высокочувствительны к вирусам гриппа А, преобладавшим в середине 30-х годов, но менее чувствительны к более поздним штаммам НО, к штаммам HI и к вирусу гриппа В (Hirst, 1947b; Sugg, Nagaki,1955). Возможно, что это действительно так, но сколько-нибудь систематических исследований по использованию хорьков для выделения вирусов А и В не проводилось после начала 40-х годов. К тому времени техника использования куриных эмбрионов получила широкое распространение, и, естественно, применение, хорьков для выделения вируса 'вышло из употребления.

Хорьки, однако, остаются широко используемой моделью для изучения гриппа человека. Картина заболевания у хорьков весьма сходна с таковой у человека (Shope, 1934, Francis, Stuart-Harris, 1938; Liu, 1955; Sugg, Nagaki, 1955; Haff et al., 1966). Разные штаммы вирусов гриппа вызывают широкий спектр аслинических проявлений болезни. Реакция на заражение варьирует от лепкой бестемпературной респираторной инфекции с очаговыми гистологическими изменениями в передней части носовых ходов (Haff et al., 1966) до острой температурной реакции с быстрым развитием некроза и отторжением клеток реснитчатого эпителия (Shope, 1934; Francis, Stuart-Harris, 1938) и даже до вирусной пневмонии с .разрушением клеток, выстилающих альвеолы (Hers, 1963; Mulder, Hers, 1972). Ранее с помощью световой микроскопии ^полученные данные о вирусопецифичееких патологических изменениях эпителия дыхательных путей были позднее подтверждены электронно-микроскопическими исследованиями (Hotz, Bang, 1957) и методом флюоресцирующих антител (Liu, 1955).

При интраназальном заражении вирус размножается в носовых раковинах, легких, трахее, пищеводе (Haff et al., 1966; Basarab, Smith, 1969). Вирус обнаруживался только в этих тканях, хотя другие (мочевой пузырь, матка, конъюнктива) тоже восприимчивы ж нему. Преимущественное размножение вируса в тканях респираторных органов наблюдается даже при внутривенном или внутрисердечном введении вируса (Basarab, Smith, 1969). Преимущественное заражение именно респираторной ткани было также подтверждено Barber и Small (1974) в опыте, при котором сформированная хирургическим путем сумка из ткани трахеи пересаживалась под кожу. Вирус поражал как трахею, так и имплантированную ткань трахеи независимо от пути заражения. Пассивная иммунизация сывороткой хорьков, содержавшей антитела против вируса, не предотвращала распространение вируса гематогенным путем.

Заражение хорьков вирусом гриппа к повышению содержания белка и кратковременному появлению нейтрализующих антител в смывах из носа, <а также к быстрому подъему уровня нейтрализующих антител IB сыворотке. После выздоровления хорьки иммунны к повторному заражению гомологичным вирусом (Smith et al., 1933; Francis, Stuart-Harris,

1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Поскольку это весьма близко напоминает реакцию на заражение у человека, возобновился интерес к удобной модели для изучения иммунитета и методов иммунизации. Potter et al. (1972a, b) и Potter (1973) в серии сообщений описали отсутствие защитного эффекта при внутримышечном введении водной инактивиро-ванной вакцины. Иммунизация с использованием адъюванта обеспечивает некоторую степень защиты и вызывает подъем уровня антигем-агглютининов в сыворотке, но иммунитет при этом не столь выражен, как после перенесенного заболевания. Это в общем соответствует данным, полученным на людях, и позволяет полагать, что отсутствие полного иммунитета при использовании убитой вакцины обусловлено ее неспособностью вызывать появление антител в секрете слизистой оболочки носа. Антитела в смывах из носа постоянно обнаруживаются при естественном заболевании (Haff, 1973).

Б. ГРЫЗУНЫ

Белые швейцарские линии мышей использовались как лабораторная (модель для изучения вирусов гриппа человека на протяжении 40 лет (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Преимущества использования мышей очевидны: малые размеры и низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более крупных и дорогих животных, например хорьков.

В отличие от хорьков мыши не обладают высокой восприимчивостью к вирусу гриппа. Интраназалыное введение инфекционного материала от больных людей не вызывает выраженной картины заболевания у мышей, хотя вирус может размножаться в легких, бронхиолах, трахее и, в меньшей степени, тканях носовой полости (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972). Поскольку размножение вируса может быть засвидетельствовано лишь посредством титрования in ovo или in vitro, нельзя считать, что выделение (вируса путем заражения мышей имеет какие-либо преимущества.. Однако после адаптации, требующей шести или более пассажей легочного экстракта, вирусы гриппа типа А начинают вызывать ярко выраженные патологические изменения в легких, а также гибель животных уже через 48 ч после интра-назального заражения. Вирусы гриппа типа В труднее адаптировать к легким мыши. Эти выраженные патологические изменения, вызываемые вирусом трилпа А, .являются генетическим признаком, но которому идет отбор, причем этот признак независим от способности вируса размножаться в легких. Высокие титры вируса могут быть получены в легких при заражении неадаптированным штаммом, но размноже-

ние при этом не 'ведет к развитию патологических изменений и гибели (Hirst, 1947a).

Несколько иная картина наблюдается яри адаптации к мышам вируса, выращенного в курином эмбрионе. Первое интраназалыгое заражение обычно вызывает развитие (поражений в леших и гибель животного, в то время как несколько последующих пассажей не вызывают патологических изменений. Это явление можно объяснить токсичностью массивной дозы вируса, который (присутствует в аллантоисной жидкости в высокой концентрации. В организме мышей накапливается при этом очень мало вируса (Sugg, 1950). Специфические поражения легких и гибель мышей отмечаются лишь после 4—10 дополнительных пассажей легочной ткани.

Поражения легких, вызываемые вирусами гриппа у мышей, представляют собой настоящую вирусную пневмонию, похожую во (Многих отношениях на вирусную пневмонию у человека (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Данные, полученные ранее с помощью световой микроскопии и указывавшие на специфическое поражение клеточного покрова альвеол, были подтверждены методом флюоресцирующих антител (Albrecht et al., 1963) и электронной микроскопией (Plum-raer, Stone, 1964). Хотя юсе клетки респираторного тракта чувствительны к 'вирусу, имеются данные о том, что у человека (см. гл. 13) клетки алывеол являются местом первоначального размножения вируса (Albrecht et al., 1963). Этот необычный восходящий путь респираторной инфекции, возможно, является скорее кажущимся, чем реальным. Когда животному под наркозом интраназально вводят вирус, он распределяется по всему респираторному тракту. Размножение вируса может -быть более быстрым в легких, чем в реснитчатом эпителии верхних дыхателыных путей.

При сублетальной инфекции вирус начинает исчезать из легких через 7 дней, что совпадает с появлением гуморальных антител. В процессе выздоровления эпителий альвеол замещается цилиндрическими и кубическими клетками .реснитчатого эпителия бронхиол. Наблюдается также метаплазия с появлением плоского эпителия (Baskerville et a]., 1974).

Поскольку воздушно-капельная передача инфекции от зараженных животных к незараженным происходит >в течение нескольких дней контакта, мыши .представляют собой прекрасную модель для изучения передачи вируса (Schulman, 1969). Мыши широко применялись также для изучения вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механизмов иммунитета (Schulman et al., 1968) и противовирусных препаратов (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

Вирусы гриппа типа А легко размножаются в легких хомяков при минимальных признаках заболевания (Friedewald, Hook, 1948). Те немногие штаммы вируса гриппа В, которые изучались в этом отношении, обладали лишь незначительной патогенностью, «о после адаптации могли вызывать поражения легких (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). В связи с низкой патогенностью вирусов гриппа для хомяков эти животные редко использовались для экспериментальных работ по гриппу. Однако недавно было обнаружено, что хомяки особенно удобны для оценки темпера-турочувствительных штаммов как пригодных для использования в качестве вакцины '(Mills, 'Chanock, 1971). Хомяк — одно из немногих лабораторных животных, имеющих температуру тела 37°С. Как и у хорьков, у хомяков не вырабатываются антитела при введении водной вакцины, если только не было предварительного заражения вирусом гриппа типа А (Potter et al., 1973).

Некоторые другие грызуны также использовались. Stuart-Harris (1937) сообщил, что вирус (гриппа может размножаться в ткани носовых раковин крыс и морских свинок, но не вызывает деструкции эпителия.

В. ПРИМАТЫ (ПОМИМО ЧЕЛОВЕКА)

Использование обезьян в качестве экспериментальной модели для изучения гриппа шло с переменным успехом. Еще в 1937 г. Mclntosh и Selbie пытались вызвать заболевание у макак резусов и зеленых мартышек вирусом H0N1, но безуспешно. Заражение макак резусов и циномольгус вирусом A/FM/1/47 .(.H1N1) дало такой же результат. Клинических проявлений болезни не наблюдалось, но были отмечены характерный некроз и десквамация эпителия (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

Saslaw и Carlisle (1965) сообщили, что при заражении аэрозолем удается получить более четкие результаты; этот путь заражения они рассматривали как более естественный, чем интраназальный или интратрахеальный. Они смогли заразить обезьян макак (резусов и циномольгус вирусом типа A/PR8/34 (H0N1). Попытки заразить обезьян штаммами вируса H2N2 и вируса гриппа В были безуспешными. Berendt (1974) тоже использовал аэрозоли с малым размером частиц и сообщил, что у 6 макак резусов, зараженных вирусом типа А/Гонконг/68 (H3N2), наблюдалось выделение вируса во внешнюю среду и (появление антител. Явных клинических проявлений болезни не было. Все животные были иммунны к повторному заражению.

Кенийские павианы (Papio sp.) оказались чувствительными к заражению штаммом H3N2, подобным А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вирус был обнаружен в смывах из глотки; кроме того, у зараженных животных и у животных, со-

державшихся в соседних клетках, появились антитела к вирусу. Клинически выраженного заболевания не было.

Среди приматов гиббоны, ©идимо, потенциально являются одной из наиболее удачных .моделей гриппа (Johnsen et al., 1971). Небольшая группа животных, зараженных штаммом А/То'Нконг/68, не проявила явных 'признаков болезни, но через 2—3 нед респираторные заболевания распространились по всей колонии гиббонов. Отмечались ринит, кашель, депрессия, похудание, желудочно-кишечные расстройства. Болезнь продолжалась в среднем 3—6 дней и выздоровление иногда затягивалось. Четыре гиббона погибли. Спектр клинических проявлений был весьма близок к наблюдаемому у людей. Вторая группа животных, получившая вирус А/Япо-ния/305/57 (H2N2), не заразилась.

В большинстве случаев для заражения обезьян использовались лабораторные штаммы, прошедшие много пассажей в куриных эмбрионах, мышах, хорьках или последовательно на разных объектах. Обезьяны, возможно, были столь же чувствительны к этим штаммам (вероятно, аттенуираванным), как человек. Можно ли успешнее заразить обезьян при использовании вируса, непосредственно полученного у людей, неизвестно. Серологические исследования, проведенные на зеленых мартышках и макаках резусах вскоре лосле их поимки, показали высокий процент антител к H3N2, начиная с 1968 г. (O'Brien, Tauraso, 1973). Сообщение Murphy и со-авт. (1972) тоже было интересным: они описали вспышку, вызванную вирусом, подобным А/Гонконг/68 у обезьян мар-мозет из Колумбии, которая началась до прибытия партии обезьян в лабораторию. Эти данные показывают, что вирус гриппа А человека .может вызывать вспышки у обезьян в определенных условиях, но высокая частота передачи инфекции, возможно, свойственна только вирусу Гонконг.

Г. ТЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА

Воздействия на системы иммунитета у зараженных гриппом животных могут представлять интерес в аспекте повышения чувствительности к инфекции у экспериментальных животных и приобретения чувствительности у невосприимчивых хозяев. Однако сообщений о таких исследованиях немного и опубликованные данные противоречивы. Сообщалось (Singer et al., 1972), что у мышей, подвергнутых действию циклофосфамида, уменьшалась тяжесть заболевания, вызванного вирусом A/PR8. Наоборот, Virelizier и соавт. (1974) нашли, что мыши, получившие циклофосфамид, намного чувствительнее к летальному действию A/PR8, чем, нормальные линии: титр препарата вируса в LD50 был по крайней мере

в 100 раз выше у .мышей, обработанных циклофосфамидом'. Mayer и соавт. (1973) тоже обнаружили, что иммуносунпрес-сия, вызванная циклофосфамидом, усиливает нейровирулент-ность вируса A/NWS. Результаты этих двух работ позволяют полагать, что гуморальные антитела являются важным фактором в выздоровлении мышей при гриппозной инфекции. Мыши с удлиненной вилочковой железой были несколько чувствительнее к вирусу PR8, чем нормальные мыши (Virelizier et al., 1974). Исследование на курах с удаленной фабри-циевой сумкой показали (Portnoy et al., 1973), что у них повышалась чувствительность к заражению ВЧП; это рассматривалось как указание на роль гуморальных антител в выздоровлении от этой инфекции.

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА

Пробы для выделения вируса следует брать не позднее чем через 3 дня после начала заболевания. Вероятность выделения вируса быстро снижается после этого срока, но в некоторых случаях вирус можно выделить на 7-й и даже 10-й день болезни. Лучше всего вирус выделяется из носовых смывов. Однако мазки, взятые из глотки и носа, 'более удобны для врача и менее неприятны для больного. Пробы, предназначенные для выделения вируса, следует постоянно держать на холоде и как можно скорее использовать. Если нельзя инокулировать их в течение 48 ч после взятия, следует поместить пробы в закрытый сосуд и .хранить в сухом льду или в рефрижераторе при —70 °С. В летальных случаях при подозрении на гриппозную пневмонию следует пытаться выделить вирус из ткани легких, слизистой трахеи, а также крови. В этих случаях выделение вируса осуществлялось с переменным успехом (iDowdle, Coleman, 1974).

Вирусы гриппа А и В размножаются в куриных эмбрионах и у ряда лабораторных животных. Куриные эмбрионы и культуры клеток точек макак резусов и зеленой мартышки считаются наиболее чувствительными для выделения вируса. Вирус гриппа типа С выделяли только на куриных эмбрионах.

Для максимально успешного выделения вирусов следует заражать 10—11-дневные эмбрионы одновременно в полости амниона и аллантоиса. Эмбрионы инкубируют при 33 °С 3— 4 дня и пробы амниотической и аллантоисной жидкости проверяют на наличие вируса, добавляя эритроциты кур или морских свинок. Эритроциты морской свинки (или группы крови 0 человека) считаются более чувствительными, чем куриные, для обнаружения вирусов H0N1 и H1N1 на ранних пассажах в курином эмбрионе. Это не относится к вирусам,

распространенным в -настоящее время: они -одинаково агглютинируют и те и другие эритроциты. Куриные эритроциты имеют некоторые преимущества: быстрее оседают, чем эритроциты (млекопитающих, титры гемагглютинации их легче учитываются и они менее 'подвержены неспецифической агглютинации сыворотками млекопитающих. В некоторых случаях необходимы два или три «слепых» амниотических иас-сажа, прежде чем вирус достигает титра, достаточного для гемагглютинации. Если вирус размножается или легко адаптируется к размножению при инокуляции в иолость аллан-тоиса, амниотичеекие пассажи не требуются.

Для выделения вируса гриппа типа С 7-дневные куриные эмбрионы заражают в полость амниона и инкубируют при 33°С 5 дней. В полости аллантоиса вирус плохо накапливается даже после (многочисленных пассажей на эмбрионах.

Клетки почек зеленых мартышек или макак резусов в мо-нослой'ной культуре в пробирках являются наиболее чувствительной культуральной системой для выделения вирусов гриппа А и В. Неопецифическое (подавление вирусов веществами, содержащимися в сыворотках в культуральной среде, является серьезной проблемой; монослой следует несколько раз промыть средой без сыворотки и использовать такую среду для поддержки культуры после заражения. Вирусы гриппа А хуже растут в культурах клеток, чем вирусы гриппа В. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект слабовыражен, непатогнамоничен, может не выявляться при первых пасса'жах. Присутствие вируса обычно устанавливается гемадсорбцией эритроцитов морской свинки (Vogel, Shelokov, 1957) в течение 3—4 дней после заражения, задолго до развития выраженного цитопатического эффекта.

Большинство выделяемых штаммов вируса гриппа типа В может быть обнаружено гемадсорбцией или тем агглютинацией в течение 3—4 дней после заражения. Цитопатический эффект обычно тоже заметен. Клетки становятся зернистыми, набухают, округляются; позднее развиваются пикноз и фрагментация, слой клеток в конце концов разрушается. Развитие цитолатичесшго действия, и накопление (гемагглютининов могут быть ускорены для вирусов А и В, если поместить пробирки во вращающийся барабан, хотя вероятность выделения вируса от этого не увеличивается.

Следует одновременно культивировать незараженные культуры клеток в пробирках, чтобы исключить возможность случайной контаминации вирусами. Вирус парагриппа типа 2 (SV5), вызывающий гемадсорбцию, является нередким кон-

таминантом в культурах почек макак резусов. Неспецифическая адсорбция старых эритроцитов характерна для большинства культур почечных клеток и может быть ошибочно принята за указание на присутствие вируса (Dowdle, Robinson, 1966), поэтому для гемадсорбции должны использоваться только свежие эритроциты. Большинство культур клеток почки макак резусов содержит вирусы типов SV40 и SV13 («пенящий» вирус). Хотя присутствие этих агентов нежелательно и может помешать интерпретации цитопатического эффекта, они не влияют, 'видимо, на чувствительность клеток •к вирусам гриппа при их выделении.

Трудно оценить количественно эффективность выделения вирусов гриппа А и В в культуре ткани и на эмбрионах. Обилие выделяемых штаммов обоих вирусов сильно варьирует по годам. Вообще говоря, культура клеток почек обезьян имеет преимущество при выделении вирусов В, но степень этого (преимущества варьирует. Вирус А еще более вариабелен и для него куриные эмбрионы чувствительнее клеточных культур. |По этой причине, а также в связи со значительной биологической (как и антигенной) изменчивостью вирусов гриппа не всегда можно сказать заранее, какой метод выделения окажется более эффективным. Заражение первичных культур почек макак резусов или зеленых мартышек одновременно с заражением куриных эмбрионов в полость аллан-. тоиса и амниона рекомендуется для выделения максимального количества штаммов вирусов гриппа А и 'В.



LITTÉRATURE

Albrecht P., Blaskovic D., Styk В., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

Andrewes С. Н., Laidlaw PP, Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber WH, Small PA Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530. Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612. Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris WJ Brit. J. exp. Path., 1974,v. 55, p. 130.

Beare AS, Keast KAJ gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

Becht И. J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

Berendt RF Infec. Immunity, 1974,

Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680. Boveridge WI В., Burnet FM Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rép. Ser.,

J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes AJ, Labzoffsky NA Arch. ges. Virusforsch., 1972

Blaskovic P., Rhodes AJ, Labzoffsky NA Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

Bd 39, S. 299.

Burnet FM Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet FM, Bull D. «.Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came PE, Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23
<< Précédente Suivant >>
= Passer au contenu du manuel =

Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала

  1. PRISE, CONDITIONS DE STOCKAGE ET LIVRAISON DU MATÉRIEL POUR LES ÉTUDES DE LABORATOIRE
    Livraison du matériel clinique et biochimique au laboratoire de diagnostic clinique En effectuant des études de laboratoire, les travailleurs de laboratoire s'efforcent de reproduire le plus précisément possible les procédures analytiques pour obtenir un résultat d'analyse fiable, mais cela est connu de la pratique de tout laboratoire: les résultats des tests de laboratoire ne sont pas toujours corrects. Parmi les nombreux facteurs
  2. Kilburn ED. Virus grippaux et grippe (1978), 1978
    Le livre est consacré à une revue d'une variété de virus grippaux, leur culture, leur biochimie et leurs caractéristiques moléculaires. Contenu: Grippe et virus grippaux. La structure du virus de la grippe. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Neuraminidase. Activité de transcriptase dans les cellules et les virions de la grippe. Virus Ribonucleic Acids
  3. Annexe 4 Grippe causée par le virus de la grippe A (H5N1) (grippe aviaire)
    La grippe aviaire est une infection virale hautement contagieuse qui peut toucher toutes les espèces d'oiseaux. Parmi les espèces domestiques, les dindes et les poulets sont les plus sensibles. Les oiseaux sauvages peuvent transmettre l'infection. Le réservoir naturel des virus de l'influenza aviaire (AIV) est la sauvagine, qui est le plus souvent responsable de l'introduction de l'infection dans les ménages. L'étiologie. AHP appartient à
  4. Lignes directrices de l'OMS sur l'échantillonnage des animaux pour le diagnostic en laboratoire d'une infection grippale (12 janvier 2005)
    Informations générales Le diagnostic réussi des infections virales dépend en grande partie de la qualité des échantillons et des conditions dans lesquelles ils ont été transportés et stockés jusqu'à ce qu'ils soient testés en laboratoire. Des échantillons pour l'isolement de virus respiratoires dans des cultures cellulaires ou des œufs de poule avec des embryons en développement et pour la détection directe d'antigènes viraux ou d'acides nucléiques,
  5. Structure du virus de la grippe
    P.V. SHOPPIN ET R.V. KOMPANS (PW CHOPPIN, J. W. COMPANS) I. INTRODUCTION L'étude du virus de la grippe est depuis longtemps «à la pointe des études structurales en virologie. Le virus de la grippe a été l'un des premiers à être étudié: en utilisant la microscopie électronique (Taylor et al., 1943), et lors de l'utilisation de cet objet particulier comme modèle, il a été «constaté que certains virus
  6. Variabilité antigénique du virus de la grippe
    RG WEBSTER et WG LEIVER i (RG WEBSTER et WG LAYER) I. INTRODUCTION Le virus de la grippe de type A1 est unique parmi les agents pathogènes des maladies infectieuses humaines en raison de sa capacité à modifier sa propre structure antigénique au point que l'immunité spécifique acquise la réponse "et l'infection par une souche est très faible ou ne protège pas contre la suivante
  7. Réplication du virus de la grippe
    K. SHOLTISSEK et H.-D. KLENK (SN. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. INTRODUCTION Il existe un certain nombre d'études sur le problème de la réplication du virus de la grippe. La littérature jusqu'en 1968 est résumée dans des articles de Hoyle (1968) 'et Scholtissek (1969); les travaux ultérieurs sont des revues de White (1973), ainsi que Compans et Choppin (1974). La plupart des données sur la réplication obtenues dans l'étude du virus de la grippe de type A. Essentiel
  8. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Activité de la transcriptase dans les cellules grippales et les virions
    RV OIMPSON et VD BIN (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. INTRODUCTION Ce chapitre «est consacré à une section relativement nouvelle de la biologie du virus de la grippe, et donc la plupart des informations sont fragmentées dans sa composition de si un grand nombre de problèmes non résolus. La principale déclaration sur laquelle repose ce chapitre est que les mycovirus sont des virus génomiques négatifs.
  9. Génétique du virus de la grippe
    A. SUGIURA I. INTRODUCTION. REVUE HISTORIQUE Ce chapitre n'est pas écrit pour donner un aperçu de toute la littérature relative à l'étude de la génétique du virus de la grippe. Cela se fait plus en détail dans les revues de Kjlbourne (1963) et Hoyle (1968). J'ai essayé de tracer, en essayant d'adhérer à l'ordre chronologique, uniquement pour les données qui ont directement conduit à des concepts importants et
  10. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  11. Protéines du virus de la grippe biologiquement actives. Hémagglutinine
    I. T. SCHULZE (I. T. SCHULZE) I. INTRODUCTION Le fait que les virus de la grippe ont la capacité d'agglutiner les globules rouges a joué un rôle important dans le développement de nos idées sur ces particules infectieuses. L'hémagglutination s'est révélée être une méthode extrêmement pratique pour identifier, purifier et déterminer la concentration de virus. De plus, depuis (le moment de la découverte du phénomène d'hémagglutinacip il y a 35 ans
  12. Virus de la grippe et grippe
    E. D. KILBOURNE I. INTRODUCTION. INFLUENZA - UNE MALADIE AUX SYMPTOMATIQUES INCHANGEABLES, CAUSÉE PAR UN VIRUS CHANGEABLE L'énorme intérêt suscité par la virologie moderne pour la grippe et les virus responsables de son apparition nécessite une explication, étant donné la nature ordinaire des symptômes de cette infection respiratoire, généralement très légère,
Portail médical "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com